组织学样本质量不仅取决于染色步骤，还受到固定、脱水、透明、包埋、脱蜡和封片等前后处理环节共同影响。不同试剂体系在组织形态保持、抗原保存、介质兼容性和显微成像质量方面存在明显差异，因此应根据样本类型和后续检测目的建立连续、匹配的处理流程。

        关键词：组织固定；组织透明；脱蜡；石蜡切片；HE染色；封片；显微制片

1 组织学样本制备的技术链条

1.1 组织固定

        组织离体后会发生自溶、蛋白降解及结构破坏，固定处理通过交联或沉淀蛋白质限制这些变化，使细胞和组织结构尽可能接近取材时状态。固定方式需要与后续石蜡包埋、冰冻切片、HE染色、特殊染色、IHC或IF等实验兼容。

1.2 脱水与透明

        固定组织含有大量水分，而石蜡及多数树脂类封片介质与水不相容，因此石蜡组织处理通常需要经过梯度乙醇脱水，再利用透明剂完成乙醇与石蜡之间的介质转换。透明不足可能导致浸蜡不充分、切片质量下降及后续染色背景异常。

1.3 包埋与切片

        石蜡包埋通过将透明后的组织浸入熔融石蜡，使组织形成具有一定机械强度的包埋块，便于获得微米级连续切片。包埋效果受前序固定、脱水和透明完整性影响，因此切片破碎、空洞或组织脱落并不一定由切片设备本身造成。

1.4 脱蜡与复水

        石蜡切片进入大多数水性染色体系前，需要先去除石蜡，再通过无水乙醇至低浓度乙醇逐步复水。石蜡残留会形成疏水屏障，限制苏木素、伊红及其他水性染液进入组织，是染色不均的重要前处理因素。

1.5 染色与封片

        染色通过不同染料与细胞核、胞质、结缔组织或特定化学成分之间的结合提高结构对比度。完成染色后，根据水性或树脂性封片体系选择脱水、透明和封片条件，使组织切片能够长期保存并维持稳定的显微观察效果。

2 固定体系的特点与选择

2.1 多聚甲醛固定

（1）固定特征

        多聚甲醛释放甲醛后与蛋白质形成交联，可较好维持细胞和组织整体结构。4%多聚甲醛是细胞、组织及免疫染色研究中常见的固定条件，其交联强度相对适中，能够兼顾形态保存和多数后续检测需求。

（2）主要优势

        多聚甲醛对组织形态和较多蛋白抗原具有较好的兼容性，适用于IHC、IF、冰冻切片及常规组织学。相较戊二醛等强交联固定剂，其对抗原表位可及性的影响通常较容易通过抗原修复或条件优化进行补偿。

（3）主要局限

        固定时间过长会增加蛋白交联程度，使部分抗原表位被遮蔽，并降低核酸和蛋白提取效率。甲醛固定对脂质本身的直接保存能力有限，因此不能覆盖所有脂质形态学或膜成分研究需求。

2.2 中性缓冲福尔马林

（1）固定特征

        中性缓冲福尔马林以甲醛为主要有效成分，通过缓冲体系维持相对稳定的pH环境，是常规病理石蜡样本处理中应用成熟的固定体系。

（2）主要优势

        其组织穿透、形态保持和石蜡制片兼容性较好，适合常规病理组织、HE染色以及多数IHC流程。对于需要标准化批量组织处理的实验，中性缓冲体系具有较好的重复性。

（3）主要局限

        长时间固定可增加蛋白交联，影响部分抗原表位和核酸质量。组织块过厚时还可能形成外层充分固定而中心固定不足的问题，因此组织尺寸、固定液体积及处理时间需要共同控制。

2.3 戊二醛固定

（1）固定特征

        戊二醛具有较强的蛋白交联能力，可形成稳定的分子网络，对细胞膜、细胞器及超微结构具有较强固定作用。

（2）主要优势

        戊二醛特别适合Transmission Electron Microscopy等超微结构研究，可较好保存线粒体、内质网、膜结构及细胞连接等细节。

（3）主要局限

        强交联会显著降低部分抗原可及性，并可能产生较明显自发荧光，因此通常不是常规IF和多数IHC实验的首选固定体系。其组织穿透速度也相对较慢，较厚样本尤其需要控制组织尺寸。

2.4 Carnoy及Clarke醇酸固定体系

（1）固定特征

        Carnoy和Clarke体系主要利用乙醇等醇类引起蛋白沉淀，并通过乙酸等组分改善核结构保存，其固定机制不同于醛类交联体系。

（2）主要优势

        固定速度快，对细胞核、染色质及部分核酸结构具有较好的保持效果，适用于强调核形态、核酸定位或特定细胞学结构的研究。

（3）主要局限

        醇类处理会引起明显脱水和组织收缩，并可抽提脂质，因此胞质、膜系统和组织整体形态保存通常弱于甲醛体系。对于需要完整膜结构或脂质成分的实验不宜优先选择。

2.5 乙醇固定

        乙醇通过脱水和蛋白沉淀实现快速固定，操作简单，适用于部分细胞涂片、细胞学染色和核酸相关实验。其主要不足是组织收缩明显，对细胞器和膜结构保存有限，因此不宜简单替代甲醛用于常规石蜡组织整体形态学评价。

表1 常用固定体系的特点与选择

3 脱水体系及处理强度

3.1 梯度乙醇脱水

（1）作用特点

        梯度乙醇通过逐步提高乙醇比例，将组织内部水分逐渐替换。70%、80%、90%、95%及无水乙醇等梯度能够降低组织由水相直接进入无水环境时发生的急剧收缩和形态改变。

（2）主要优势

        渐进式脱水有利于保持组织形态，并提高后续透明剂进入的均一性，是石蜡包埋流程中稳定性较高的脱水方式。对于较厚组织，通过延长中间梯度时间通常比直接延长无水乙醇阶段更有利于均匀脱水。

（3）主要局限

        梯度脱水步骤较多，高浓度乙醇处理过久仍可导致组织硬化、收缩及脆性增加。组织大小、脂肪含量、纤维化程度和前期固定条件都会改变适宜脱水时间。

3.2 脱水不足

        组织中残留水分会降低二甲苯或环保透明剂的渗透效率，表现为组织透明不充分、局部发白、浸蜡困难或切片出现孔洞。此类问题不能依靠单纯延长浸蜡时间补偿，应首先检查高浓度乙醇阶段是否充分以及无水乙醇是否吸水失效。

3.3 过度脱水

        过度脱水可使组织变硬、变脆并出现明显收缩，尤其对小组织和柔软组织影响更明显。脱水终点应以完成水分置换并保持结构完整为目标，而不是简单追求更长的无水乙醇处理时间。

4 透明体系的类型与差异

4.1 乳酸透明液

（1）作用特点

        乳酸透明液主要用于部分植物病组织及整体样本，通过降低组织背景和改善光线透过，使菌丝、孢子及其他内部结构更容易在显微镜下观察。

（2）主要优势

        样本可保持较完整的空间结构，无需经过石蜡包埋和切片，适合观察病原体在叶片或其他植物组织中的分布以及整体组织内部结构。

（3）主要局限

        乳酸透明通常处理速度较慢，且其主要目标是整体组织观察，并不承担石蜡组织处理中乙醇—石蜡介质转换或石蜡溶解，因此不能替代常规石蜡脱蜡剂。

4.2 乳酚透明体系

（1）作用特点

        乳酚体系兼具组织透明和真菌结构观察功能，与乳酚蓝等染色剂结合后，可提高菌丝、孢子等结构的显微对比度。

（2）主要优势

        适用于真菌形态及植物病原真菌观察，透明与染色可形成连续处理流程，尤其适合无需石蜡包埋的微生物或整体组织样本。

（3）主要局限

        应用对象相对专一，不属于动物组织常规石蜡制片的通用透明体系，也不适合替代二甲苯或环保型石蜡透明剂。

4.3 二甲苯透明体系

（1）作用特点

        二甲苯与无水乙醇和石蜡均具有较好的相容性，可用于组织浸蜡前透明、石蜡切片脱蜡以及染色后树脂封片前透明。

（2）主要优势

        石蜡溶解能力较强，介质转换效率高，传统石蜡制片流程经验成熟，并与多数树脂性封片剂具有良好兼容性。

（3）主要局限

        二甲苯具有较明显挥发性和刺激性，需要良好通风和规范实验室暴露控制。组织在二甲苯中停留时间过长还可能增加硬化和脆性。

4.4 环保浸蜡脱蜡透明液

（1）作用特点

        环保型浸蜡脱蜡透明液用于替代部分传统芳香族透明剂，可覆盖组织浸蜡前透明、石蜡切片脱蜡及染色后透明等多个阶段。

（2）主要优势

        功能覆盖范围较广，可在一个体系中完成石蜡组织处理中的多项介质转换，并减少传统芳香族透明溶剂的使用，适合常规石蜡制片及部分IHC流程。

（3）主要局限

        不同石蜡配方、切片厚度和组织处理程序会影响实际脱蜡效率，更换透明剂后仍需验证脱蜡时间、组织形态及染色一致性，不能简单按原二甲苯时间机械替换。

4.5 环保脱蜡液

        环保脱蜡液的功能更集中于石蜡去除和染色前处理，适合需要降低传统二甲苯使用量的切片流程。与能够兼顾浸蜡前透明的环保浸蜡脱蜡透明液相比，其实验定位更偏向切片阶段，因此选择时应明确所需的是“全流程透明介质”还是“单纯脱蜡体系”。

表2 常用透明与脱蜡体系比较

5 石蜡包埋与切片质量

5.1 石蜡浸润

        透明后的组织进入熔融石蜡，使透明介质逐渐被石蜡替换。石蜡需要充分进入组织间隙并形成均一支撑，浸蜡不足会造成组织中心松软和切片断裂，而温度过高或处理时间过长则可能增加组织硬化并影响部分抗原。

5.2 包埋质量

        包埋方向、石蜡状态和组织浸润完整性共同决定后续切面。皮肤、胃肠道、管腔组织及不同层次结构的样本需要根据观察目标确定包埋方向，否则即使切片本身完整，也可能无法获得具有分析价值的组织结构。

5.3 切片异常的来源

        连续切片破碎、孔洞、组织脱落或切面不均不一定由切片机或刀片引起。固定过度、脱水不足、组织过硬、浸蜡不充分和包埋方向错误均可能产生类似问题，需要结合前处理流程进行溯源。

6 石蜡切片脱蜡与复水

6.1 脱蜡完整性

        切片中的石蜡会阻止水性染液进入组织，因此脱蜡必须在复水前充分完成。脱蜡不足常表现为切片局部拒液、HE浅染、染色斑片化或IHC反应不均，是石蜡染色中常见的前处理异常。

6.2 复水梯度

        透明剂去除后需要经无水乙醇、高浓度乙醇和低浓度乙醇逐步进入水相，使组织重新适应水性染色环境。稳定的梯度介质转换可减少组织形态改变，并提高水性染液渗透的一致性。

6.3 脱蜡剂选择

        二甲苯适合成熟的传统石蜡流程，脱蜡速度快、与树脂封片兼容性好；环保脱蜡剂则更适合需要降低芳香族溶剂使用的实验室。选择时除脱蜡速度外，还应比较组织形态、染色背景、抗原保存及与既有自动染色流程的兼容性。

7 苏木素与伊红染色体系

7.1 苏木素染色体系

（1）Mayer苏木素

        Mayer体系通常属于较温和的渐进式核染色体系，背景相对较低，适合常规核染色和IHC复染。其优势是较容易控制核染色深度，分化要求相对较低；局限是达到较深核染色通常需要更长处理时间。

（2）Harris苏木素

        Harris体系核染色速度快、着色较强，适合常规HE及需要明显核对比度的样本。其主要局限是容易出现过染，需要严格控制染色和分化时间。

（3）Gill苏木素

        Gill系列可根据不同浓度获得不同染色强度，适用于组织学和细胞学核染色。其优势是标准化程度较高，能够根据样本和应用选择不同配方；局限是不同组织厚度和染色程序之间仍需进行时间优化。

（4）Cole苏木素

        Cole体系可用于常规组织学核染色。其适用性应根据核染色强度、背景、分化需求以及与伊红的综合色彩对比进行评价，而不宜直接按照其他苏木素体系的染色时间进行替换。

7.2 伊红染色体系

（1）水溶性伊红

        水溶性伊红在水相条件下与胞质和多种蛋白结构结合，操作方便，适合常规HE染色。染色结束后仍需通过乙醇脱水，因此后续乙醇处理时间会继续影响最终伊红深度。

（2）醇溶性伊红

        醇溶性伊红能够更直接地与乙醇脱水体系衔接，适合部分石蜡HE程序。其优势是介质转换相对简洁，但染色效果对乙醇浓度、染液状态和处理时间较敏感。

表3 常见HE染色体系的选择特点

8 封片体系的特点与选择

8.1 加拿大树脂

        加拿大树脂属于传统树脂性永久封片介质，具有较好的光学透明性，适合完成脱水和透明后的组织切片。其优势是制片稳定、适合长期明场保存；局限是样本必须充分脱水和透明，不适合直接用于含水样本。

8.2 中性树胶

        中性树胶广泛用于HE及其他常规组织染色后的永久封片，与二甲苯类透明体系具有较好的衔接性。其操作成熟、成像稳定，但若切片残留水分或低浓度乙醇，容易出现乳白、浑浊和折光异常。

8.3 甘油体系

        甘油类介质适用于部分水性临时制片、植物及微生物整体样本观察，可省略复杂的脱水和有机透明过程。其优势是操作简单并兼容水相样本，但长期保存稳定性和机械稳定性通常不及树脂类永久封片。

8.4 抗荧光淬灭封片液

        抗荧光淬灭封片体系用于IF及其他荧光样本，重点在于延缓Fluorophore光漂白并保持荧光信号，而不是提高传统明场切片的折射透明度。其选择应与荧光染料、显微镜成像方式和保存时间相匹配，不能简单替代HE使用的树脂型封片剂。

表4 常用封片体系比较

9 常见制片异常及结果判读

9.1 组织中心透明或浸蜡不足

        组织中心发白、切片出现孔洞或局部松散通常提示前序脱水和透明不足。应优先检查组织块厚度、高浓度乙醇脱水是否充分、透明时间是否匹配以及透明剂是否吸水或失效。

9.2 切片局部拒水或浅染

        脱蜡不充分会使残留石蜡阻断水性染液进入，产生局部拒水、浅染或斑片状染色。应比较脱蜡剂类型、处理时间、温度及试剂重复使用程度，并检查切片是否因石蜡配方或厚度改变而需要调整流程。

9.3 组织过硬或破碎

        组织过硬可能来自过度固定、过度脱水、透明时间过长或浸蜡温度过高。多个步骤可形成相似表型，因此需要根据问题出现阶段回溯整个前处理流程，而不能仅通过更换刀片或调整切片厚度处理。

9.4 核染色过深或过浅

        核染色过深通常与苏木素处理过长或分化不足有关；核染色过浅则可能由染液活性降低、脱蜡复水不充分或过度分化造成。判读时需要同时考虑染色剂状态和前处理完整性。

9.5 封片后浑浊

        树脂封片后出现乳白、折光不均或局部浑浊时，应重点检查水分或低浓度乙醇残留、染色后脱水完整性、透明程度以及封片剂与透明剂的兼容性。单纯增加封片剂用量通常不能解决介质转换不完整的问题。

10 组织固定、透明、脱蜡、染色与封片相关产品

10.1 固定与组织前处理产品

10.2 透明、脱蜡与介质转换产品

10.3 染色与显微观察产品

10.4 封片相关产品

        组织学制片不存在适用于所有样本的单一处理体系。固定阶段需要在组织形态、抗原可及性和超微结构保存之间权衡，透明与脱蜡阶段需要兼顾介质转换效率、石蜡溶解能力及组织硬化风险，染色和封片则应依据明场、IHC或荧光观察目的选择相应体系。

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