经典PROTAC依赖E3泛素连接酶和蛋白酶体清除胞内靶蛋白，但难以覆盖胞外蛋白、大尺度细胞组分及细菌蛋白。LYTAC、ATTEC、AUTAC和BacPROTAC分别利用内吞-溶酶体、自噬-溶酶体或原核蛋白酶系统，为不同空间位置和物理尺度的靶标建立定向清除途径。

        关键词：PROTAC；靶向蛋白降解；LYTAC；ATTEC；AUTAC；BacPROTAC；ClpCP；自噬溶酶体

1 经典PROTAC的降解基础与作用边界

1.1 泛素-蛋白酶体系统的底物处理逻辑

（1）泛素标记与蛋白酶体识别

        泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）通过E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶依次完成泛素活化、转移及底物选择。靶蛋白形成适于26S蛋白酶体识别的多聚泛素信号后，经过去泛素化、ATP依赖性解折叠和多肽链转运，最终进入蛋白酶体催化核心完成水解。E3连接酶承担关键的底物选择功能，是PROTAC能够重新定向UPS的重要分子节点。

（2）PROTAC对E3底物选择的重编程

        PROTAC通过双功能结构诱导靶蛋白与特定E3连接酶形成新的空间接近关系，使原本并非该E3天然底物的蛋白获得泛素化机会。其药理作用不依赖持续占据靶蛋白功能位点，而依赖成功触发“靶标招募—泛素化—蛋白酶体清除”事件。因此，PROTAC活性评价除配体结合外，还需要确认靶蛋白丰度下降及其对E3和蛋白酶体的依赖性。

1.2 POI–PROTAC–E3三元复合物

（1）三个结构模块

        经典PROTAC通常由靶蛋白配体（POI ligand）、Linker和E3连接酶配体组成。POI配体决定靶标识别范围，E3配体决定被招募的泛素连接酶，Linker则调控两种蛋白之间的距离、相对取向及构象自由度。Linker并非单纯的连接单元，其长度、刚柔性、化学组成和连接位点均可显著改变三元复合物构象。

（2）亲和力与降解效率

        高二元亲和力并不必然对应高降解效率。三元复合物形成后，靶蛋白表面可泛素化赖氨酸的空间可及性、E2–E3催化区域与靶蛋白之间的相对位置、复合物寿命及泛素链延伸效率均会影响最终降解。由此，PROTAC优化的核心不仅是增强配体结合，还包括获得有利于泛素转移和后续蛋白酶体处理的三元复合物构型。

1.3 协同性与hook effect

（1）三元复合物协同性

        POI与E3进入同一三元复合物后，两种蛋白表面之间可能形成额外的蛋白-蛋白相互作用，其影响通常以协同性参数α描述。α>1表示正协同，三元复合物较独立二元结合预测更稳定；α<1表示负协同。Linker长度、连接位点、出口向量以及蛋白界面互补性均可改变协同性，是PROTAC结构优化的重要参数。

（2）hook effect

        PROTAC浓度过高时，POI和E3可能分别被不同PROTAC分子占据，导致POI–PROTAC和PROTAC–E3二元复合物比例升高，而有效POI–PROTAC–E3三元复合物比例下降，最终出现降解活性随浓度先升高后降低的钟形关系，即hook effect。剂量评价应覆盖低、中、高浓度范围，以避免仅依据高浓度结果低估真实降解能力。

2 蛋白酶体之外的靶向降解需求

2.1 蛋白酶体的底物尺度限制

（1）单蛋白底物处理

        26S蛋白酶体的蛋白水解核心具有受限入口，目标蛋白通常需要先被识别并完成ATP依赖性解折叠，再以展开的多肽链形式进入催化腔室。因此，蛋白酶体更适于处理能够被单独识别、机械解折叠并连续转运的蛋白质底物。

（2）大尺度细胞组分清除

        蛋白聚集体、脂滴、膜性结构和完整细胞器无法作为整体进入蛋白酶体核心。自噬体可通过膜延伸和包裹容纳更大尺度的底物，并在与溶酶体融合后完成降解，因此大型蛋白复合物、聚集体和细胞器更适合采用自噬-溶酶体途径。

2.2 胞外靶标的空间限制

        E3连接酶和26S蛋白酶体主要分布于胞质和细胞核，而分泌蛋白及膜蛋白胞外结构域位于细胞外环境。对于EGFR、PD-L1等膜蛋白，即使获得高亲和力胞外结合配体，也无法直接建立经典POI–PROTAC–E3复合物。此类靶标需要借助受体介导内吞进入内体系统，并进一步递送至溶酶体，因此降解策略的核心由E3选择转变为内吞受体选择和胞内运输调控。

2.3 原核细胞缺乏经典真核UPS

（1）传统PROTAC链路的限制

        多数细菌不存在完整的真核E3–泛素–26S蛋白酶体系统，因此传统PROTAC依赖的E3招募、泛素化和蛋白酶体识别链路不能直接应用于原核细胞。

（2）原核蛋白酶系统的替代作用

        细菌具有Clp、Lon等ATP依赖性蛋白质质量控制系统，其中ClpATPase负责底物识别、解折叠和转运，蛋白酶核心负责后续水解。BacPROTAC利用这些内源性原核蛋白酶，将诱导接近和底物重新定向的设计原则从E3连接酶扩展至Clp蛋白酶系统。

3 LYTAC介导的胞外与膜蛋白降解

3.1 内吞受体介导的靶标递送

（1）靶标与内吞受体桥接

        LYTAC（lysosome-targeting chimera）的一端识别胞外蛋白或膜表面靶标，另一端结合具有内吞能力的细胞表面受体。形成靶标–LYTAC–受体复合物后，整个复合物进入受体介导的内吞过程，使胞外靶标进入胞内囊泡运输系统。

（2）内体-溶酶体转运

        复合物进入早期内体后，随内体成熟进入逐渐酸化的环境。部分运输受体可循环返回细胞表面，而目标蛋白继续向晚期内体和溶酶体转运，最终由组织蛋白酶等酸性水解酶分解。LYTAC因此利用的是细胞固有的“表面受体—内体—溶酶体”运输轴，而非胞质UPS。

3.2 受体类型与LYTAC适用范围

（1）CI-M6PR体系

        CI-M6PR具有受体介导内吞和溶酶体运输功能，可作为相对广泛的LYTAC招募受体。其降解效率不仅受靶标和受体亲和力影响，还与受体结合价态、内吞效率、胞内分选及受体循环能力相关。

（2）ASGPR体系

        ASGPR在肝细胞中高表达，可通过糖配体实现高效内吞，因此适合构建具有肝细胞偏向性的LYTAC。受体选择由此不仅决定靶标是否能够进入溶酶体，也可能影响降解分子的细胞及组织选择性。

3.3 LYTAC降解判定

        细胞表面靶标信号降低不能单独证明靶蛋白已经降解，因为受体介导内吞本身即可降低膜表面信号。较完整的机制证据应包括表面靶标内化、细胞总靶蛋白下降以及溶酶体功能阻断后的降解救援；若表面蛋白降低而总蛋白基本不变，则更支持胞内转运或重新分布，而非终末降解。

4 ATTEC与AUTAC介导的自噬靶向清除

4.1 ATTEC通过LC3直接募集靶标

（1）LC3作为自噬体招募节点

        LC3家族蛋白经脂质化形成膜结合型LC3-II后定位于自噬体膜，是自噬膜形成及底物识别的重要节点。ATTEC（autophagosome-tethering compound）通过同时结合目标对象和LC3，增加靶标与自噬膜之间的空间接近，使目标进入自噬体并随其成熟后转运至溶酶体。

（2）异常蛋白清除

        突变型亨廷顿蛋白（mHTT）是ATTEC的代表性研究对象。ATTEC通过靶标识别端结合mHTT，并通过另一功能端结合LC3，提高异常蛋白进入自噬体的概率。若靶标配体能够区分突变型和野生型HTT，则可进一步形成选择性清除。

（3）非蛋白结构清除

        ATTEC还可用于脂滴等非蛋白细胞结构。脂滴靶向分子一端与脂滴结合，另一端募集LC3，可促进脂滴进入脂噬过程。这类研究表明，ATTEC的作用对象并不局限于单一蛋白，而可扩展至具有可识别界面的细胞结构。

4.2 AUTAC通过选择性自噬改变靶标命运

（1）选择性自噬标签

        AUTAC（autophagy-targeting chimera）与ATTEC的主要差异在于其并非以靶标-LC3直接桥接为核心。代表性AUTAC利用自噬诱导标签改变目标对象的质量控制状态，使其更容易被选择性自噬系统识别，并进一步进入自噬体。

（2）K63连接型泛素信号

        部分AUTAC体系可促进目标附近形成K63连接型泛素信号。该类泛素链与经典PROTAC中主要服务于蛋白酶体递送的泛素信号具有不同功能定位，更多参与选择性自噬识别，并可通过SQSTM1/p62等自噬受体连接至LC3阳性自噬膜。由此，非蛋白酶体降解并不意味着整个过程完全不涉及泛素，而是终末降解系统不再是26S蛋白酶体。

（3）细胞器清除

        AUTAC可进一步用于受损线粒体等大型细胞器。完整线粒体无法进入26S蛋白酶体，但可被自噬膜包裹并通过线粒体自噬进入溶酶体清除。针对细胞器的降解评价应关注细胞器总体质量或数量变化，而不能仅依据单一线粒体蛋白或膜电位变化进行判断。

4.3 ATTEC与AUTAC的机制差异

5 BacPROTAC介导的细菌Clp蛋白酶重编程

5.1 Clp蛋白酶的底物处理机制

（1）ClpC/ClpC1的识别与解折叠功能

        Clp家族蛋白酶通常由AAA+ ATPase和蛋白水解核心组成。ClpC或ClpC1负责识别并结合底物，通过ATP水解产生机械力，使折叠蛋白逐步展开为能够进入蛋白酶核心的多肽链。

（2）ClpP/P1P2的蛋白水解功能

        ClpP及分枝杆菌P1P2蛋白酶核心内部具有受限的水解腔室，完整折叠蛋白通常不能直接进入，需要ClpC/ClpC1完成捕获、解折叠和转运。因此，BacPROTAC主要重编程的是Clp系统的底物识别入口，而非直接改变ClpP催化中心。

5.2 pArg介导的ClpCP底物识别

（1）pArg质量控制标签

        在部分革兰氏阳性菌中，磷酸精氨酸（phosphoarginine，pArg）可作为蛋白质量控制标签，被ClpC氨基末端结构域识别并导向ClpCP。其与真核泛素的共同特征在于均能够为降解系统提供底物选择信息，但分子结构和识别机制完全不同。

（2）mSA概念验证

        早期BacPROTAC研究将能够结合单体链霉亲和素（mSA）的生物素与ClpC识别基团连接，使mSA被人工募集至ClpCP并进入蛋白水解过程。该体系证明，双功能分子能够改变原核蛋白酶的底物选择范围，使原本并非ClpCP天然底物的蛋白获得降解能力。

5.3 BacPROTAC三元复合物

（1）POI识别端

        BacPROTAC一端采用目标蛋白配体决定底物选择性。例如JQ1可作为BET溴结构域模型的识别配体，其功能是将特定蛋白纳入诱导接近体系，而非直接介导蛋白水解。

（2）ClpC/ClpC1招募端

        另一端连接ClpC或ClpC1结合基团，使目标蛋白、BacPROTAC和ClpATPase形成三元复合物。ClpC/ClpC1随后完成目标蛋白捕获和ATP依赖性解折叠，并将多肽链转运至ClpP或P1P2蛋白水解核心，不需要经典PROTAC中的E3招募和多聚泛素化步骤。

（3）Linker几何效应

        Linker长度、柔性和连接位点会改变POI与ClpC/ClpC1之间的相对位置。Linker过短可能限制双端同时结合，过长则可能降低有效接近概率；POI的相对取向还会影响其是否能够进入AAA+ ATPase底物处理通路。因此，BacPROTAC同样需要评价完整三元复合物结构，而不能仅依据两个配体的独立Kd判断降解能力。

5.4 ClpC1小分子配体的应用

        pArg适于进行机制验证，但在化学稳定性和细胞内应用方面存在限制。后续BacPROTAC设计可采用能够稳定结合ClpC/ClpC1的小分子招募基团，并与JQ1等POI配体连接，以利用ClpC1P1P2系统处理模型底物。部分ClpC/ClpC1配体还可影响AAA+ ATPase寡聚状态和功能活性，因此其作用可能同时涉及底物重新定向和蛋白酶机器状态调控。

5.5 BacPROTAC与经典PROTAC的机制比较

（1）共同的诱导接近原则

        两类技术均通过双功能分子建立目标蛋白与内源性降解系统之间新的识别关系，从而改变降解系统的底物谱。

（2）不同的执行链路

        经典PROTAC：POI→PROTAC→E3连接酶→泛素化→26S蛋白酶体。

        BacPROTAC：POI→BacPROTAC→ClpC/ClpC1→ATP依赖性解折叠→ClpP/P1P2蛋白水解。

        BacPROTAC代表的是诱导接近型靶向降解原则向原核蛋白质质量控制系统的迁移，而非经典PROTAC简单替换E3配体。

6 不同靶标的降解平台选择

6.1 靶标空间与底物尺度

6.2 配体可获得性并非唯一决定因素

（1）PROTAC

        除POI配体外，还需要目标细胞具有适宜E3表达，并形成有利于泛素转移的三元复合物界面。若靶蛋白缺乏合适的E3接近构型，提高POI配体亲和力也可能无法显著改善降解。

（2）LYTAC

        LYTAC需要同时满足靶标结合、受体结合、有效内吞及溶酶体分选。受体类型、内吞速率、胞内运输和受体循环均会影响最终靶蛋白清除效率。

（3）ATTEC与AUTAC

        目标需要能够进入自噬体，同时细胞应具有完整的自噬通量和溶酶体降解能力。若自噬体形成正常但终末溶酶体功能受损，提高靶标招募效率仍可能导致中间体积累而非有效清除。

（4）BacPROTAC

        除目标蛋白和ClpC/ClpC1配体外，还需要考虑细菌细胞包膜通透性、外排系统、Clp蛋白酶表达及目标蛋白能否被AAA+ ATPase有效捕获和解折叠。体外三元复合物形成并不能直接等同于细菌细胞内的有效降解。

7 分子胶与RIBOTAC的机制边界

7.1 分子胶并不等同于非UPS降解剂

（1）结构形式

        分子胶通常缺乏典型的“POI配体-Linker-E3配体”双功能结构，而通过相对紧凑的小分子诱导或稳定新的蛋白-蛋白相互作用，从而改变天然蛋白识别关系。

（2）降解型分子胶的UPS依赖性

        Thalidomide、Pomalidomide及多种CELMoD可结合CRBN并重塑CRL4CRBN的底物识别界面，使新的底物发生泛素化并进入蛋白酶体。因此，“分子胶”界定的是诱导蛋白相互作用的分子方式，而不是终末降解途径，不能将其统一归入非泛素-蛋白酶体降解体系。

7.2 RIBOTAC扩展靶向降解对象

        RIBOTAC（ribonuclease-targeting chimera）通过一端识别特定RNA结构、另一端招募内源性核糖核酸酶，使目标RNA发生选择性切割。其与PROTAC的共同基础是选择性识别目标并重新定向内源性清除系统，而非使用相同底物或降解途径，因此代表了诱导降解策略由蛋白质向RNA靶标的延伸。

8 靶向降解机制的实验判定

8.1 靶标丰度下降的证据边界

（1）排除表达水平变化

        Western blot检测到目标蛋白下降只能证明蛋白丰度发生变化，转录抑制、翻译抑制、细胞死亡及蛋白分泌变化均可能产生相似结果。可结合mRNA水平、细胞活性和时间序列分析，区分主动蛋白降解与表达量减少。

（2）确认降解系统依赖性

        靶向降解需要进一步证明预期清除系统参与，并观察阻断该系统后靶标下降是否获得救援。不同平台最具区分度的证据并非单纯的目标蛋白降低，而是其对应的E3、溶酶体、自噬或Clp蛋白酶依赖性。

8.2 PROTAC验证

（1）直接降解读出

        应建立浓度-降解和时间-降解曲线，评价Dmax等参数，并覆盖足够宽的浓度范围，以识别可能存在的hook effect。

（2）UPS机制验证

        可结合靶蛋白泛素化、相应E3连接酶敲低/敲除以及蛋白酶体阻断实验。E3缺失或蛋白酶体功能受阻后降解效应显著减弱，可支持UPS依赖性机制。

8.3 LYTAC验证

（1）区分内化与降解

        应分别检测细胞表面靶标和总靶蛋白。表面水平下降而总蛋白保持稳定时，更支持内吞和重新分布；总蛋白持续下降则更符合实际降解。

（2）确认溶酶体依赖性

        结合溶酶体酸化抑制、溶酶体功能干预及靶标与LAMP1/LAMP2等标志物的空间共定位，可判断目标是否进入终末溶酶体降解区室。

8.4 ATTEC与AUTAC验证

（1）ATTEC

        应综合评价靶标下降、靶标-LC3接近、自噬通量及自噬/溶酶体阻断后的降解救援。LC3-II单独升高不能作为充分证据，因为该变化既可能来源于自噬增强，也可能来源于自噬通量受阻。

（2）AUTAC

        应评价目标清除、选择性自噬及溶酶体依赖性；涉及K63连接型泛素的体系可进一步检测相应泛素信号。针对线粒体等细胞器，还应检测细胞器质量或数量变化，避免将膜电位降低等功能异常误判为实际清除。

8.5 BacPROTAC验证

        BacPROTAC应同时验证目标蛋白下降、ClpC/ClpC1依赖性及相应蛋白酶核心依赖性。体外重组体系可直接评价BacPROTAC是否促进POI被Clp系统水解，细胞内则可利用Clp功能缺失或受阻模型判断目标蛋白下降是否同步减弱，从而区分Clp依赖性蛋白降解、POI配体直接功能抑制及非特异性细胞毒性。

9 靶向降解、通路验证与分子构建相关产品

9.1 AUTAC及自噬-溶酶体通路相关产品

9.2 BacPROTAC靶标配体及UPS机制对照产品

9.3 PROTAC构建模块及经典降解机制对照产品

        LYTAC、ATTEC、AUTAC和BacPROTAC分别扩展了经典PROTAC在靶标空间位置、底物尺度及生物体系方面的适用边界。不同平台的选择取决于靶标的生物学位置、结构特征以及与相应内源性清除系统的适配性。

参考文献

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[4] 蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）：分子设计、降解机制、实验评价及研究工具

[5] 泛素系统的结构编码与蛋白质稳态调控机制

[6] 泛素-蛋白酶体系统（UPS）

[7] CXCR4：细胞外泛素的受体