导读

         多肽合成中的异常杂质通常不是单一因素造成的，而是序列特征、保护基策略、试剂状态、洗涤效率和后处理条件共同作用的结果。在固相多肽合成（Solid-Phase Peptide Synthesis，SPPS）中，氨基既是肽链延伸的关键反应位点，也是非目标酰化、烷基化和封端副反应的重要来源。本文从氨基副反应出发，围绕异常杂质的来源判断、实验步骤定位、分析信号解读和工艺优化方法展开，帮助实验人员建立清晰、可执行的排查思路。

1. 异常杂质为什么应先关注氨基

1.1 游离氨基是肽链延伸的核心反应位点

         多肽合成的本质是氨基与活化羧基形成酰胺键。在 9-芴甲氧羰基固相多肽合成法（Fmoc-SPPS）中，每延长一个氨基酸，通常要经历 Fmoc 脱保护、洗涤、偶联和再洗涤等步骤。脱保护后形成的 N 端游离氨基，是下一轮偶联反应的必要位点。

         游离氨基具有较强亲核性。除了能与目标氨基酸的活化羧基反应，也可能与体系中的其他亲电性物质发生副反应。例如乙酸酐、活化酯残留、保护基裂解产物、部分醛类杂质或溶剂降解物，都可能在特定条件下与游离氨基反应，形成非目标修饰。

         因此，当高效液相色谱（HPLC）图谱中出现异常峰，或液相色谱-质谱联用（LC-MS）显示异常质量变化时，氨基相关副反应应作为重要排查方向。

1.2 氨基副反应通常表现为三类问题

         氨基副反应在最终分析结果中，通常表现为以下三类问题：

2. 按实验步骤定位杂质来源

2.1 偶联阶段：重点排查缺失肽和未完全反应

         偶联阶段的目标是让树脂上的游离氨基与被活化的氨基酸羧基反应。如果偶联不完全，后续步骤中未反应氨基可能继续参与副反应，形成缺失肽、截短肽或封端杂质。偶联阶段应重点检查：

         如果 LC-MS 显示少一个氨基酸残基的杂质，应优先检查对应位点的偶联效率。对于缬氨酸（Valine，Val）、异亮氨酸（Isoleucine，Ile）、叔亮氨酸（tert-Leucine，Tle）或α-氨基异丁酸（2-aminoisobutyric acid，Aib）等空间位阻较大的残基，必要时可采用双偶联、延长偶联或更换偶联体系。

2.2 封端阶段：重点排查非目标乙酰化

         封端常用于处理未偶联成功的游离氨基，使其不再参与后续链延伸。常见封端试剂包括乙酸酐等酰化试剂。合理封端可以减少缺失序列继续延伸形成复杂杂质，但封端条件控制不当也可能带来非目标乙酰化。需要重点区分两种情况：

非目标乙酰化可能来自以下环节：

         ①封端试剂过量或反应时间过长；

         ②封端后洗涤不充分；

         ③上一步偶联失败后，未反应氨基被封端；

         ④赖氨酸（Lysine，Lys）侧链保护基选择或使用不当、保护基异常脱除，或原料中存在未保护/低保护杂质；

         ⑤残留乙酰化活性物质进入后续步骤。

         如果检测到乙酰化截短肽，不应只认为是“封端造成的杂质”。更准确的判断是：封端前可能已经存在偶联不完全，封端只是把未延伸的氨基固定为乙酰化终止结构。

2.3 脱保护阶段：重点排查脱保护不完全和副产物残留

         在 Fmoc-SPPS 中，Fmoc 基团通常用哌啶等碱性试剂脱除。该过程中会生成高反应性的二苯并富烯（dibenzofulvene，DBF）中间体，正常情况下 DBF 会被过量哌啶等二级胺捕获，形成较稳定加合物。如果脱保护液状态、处理时间、树脂内部扩散或洗涤效率不佳，可能出现脱保护不完全、DBF 相关残留/加合风险或副产物残留。脱保护阶段主要关注两个问题：

         对于长肽、疏水肽或易聚集序列，树脂内部扩散受限，脱保护和洗涤效率可能下降。此时不能只延长脱保护时间，还应考虑增加洗涤效率、优化溶剂体系或调整树脂载量。

2.4 切割和全脱保护阶段：重点排查酸处理副反应

Fmoc-SPPS 完成后，常使用三氟乙酸（TFA）体系将多肽从树脂上切割下来，同时脱除多数酸敏感侧链保护基。TFA 切割体系常加入水、三异丙基硅烷（TIS）、乙二硫醇（EDT）等清除剂，用于捕获反应过程中产生的活性中间体。这一阶段常见风险包括：

         ①酸处理时间过长导致敏感序列降解；

         ②清除剂组合不合适，活性中间体未被充分捕获；

         ③色氨酸（Tryptophan，Trp）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）、甲硫氨酸（Methionine，Met）等残基出现副反应；

         ④切割后沉淀、洗涤或干燥不及时，导致后续变化增加。

2.5 纯化和后处理阶段：重点排查杂质谱变化

         反相高效液相色谱（RP-HPLC）常用于多肽纯化。流动相中常加入 TFA、甲酸或乙酸以改善峰形和分离效果。对多数多肽而言，这些条件是常规且有效的；但对部分敏感序列，长时间酸性放置、反复冻融、浓缩干燥或高温处理可能改变杂质谱。

如果粗肽图谱较好，而纯化后或放置后杂质增加，应优先检查：

         ①样品溶液是否长时间处于酸性条件；

         ②收集馏分是否及时冻干；

         ③浓缩温度是否过高；

         ④是否经历反复冻融；

         ⑤分析方法中的酸性添加剂是否适合该序列。

3. 按异常信号反推副反应类型

3.1 出现截短肽：优先排查偶联、脱保护和封端

截短肽通常表现为目标肽少一个或多个氨基酸残基。其来源主要包括：

         ①某一步偶联不完全；

         ②上一步 Fmoc 脱保护不完全；

         ③未偶联氨基被封端；

         ④N 端发生非目标酰化，导致链延伸终止。

         排查顺序建议如下：

         如果截短肽同时带有乙酰化质量变化，优先检查“偶联不完全 + 封端”这一路径。

3.2 出现酰化类质量增加：区分乙酰化、甲酰化和三氟乙酰化

         酰化类杂质是氨基副反应中较常见的一类。不同酰化类型对应的排查方向不同。

         其中，N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）需要重点关注。DMF 长期暴露于空气和水分后可能产生二甲胺和甲酸；其中二甲胺可导致 Fmoc 保护基非预期脱除，影响树脂装载量或后续合成质量。若怀疑甲酰化，应结合甲酸使用、活化剂/脱水条件、样品浓缩干燥、温度和放置时间综合判断，而不宜仅凭使用 DMF 或甲酸就直接定性为甲酰化来源。

3.3 出现 N-烷基化相关杂质：优先排查脱保护副产物和清除剂

N-烷基化是游离氨基与烷基化物质反应形成的副产物。其来源可能包括保护基裂解产物、醛类杂质、树脂连接臂相关活性物质或脱保护体系中的反应中间体。常见排查方向包括：

         ①Fmoc 脱保护液是否新鲜；

         ②哌啶浓度和处理时间是否合适；

         ③DBF 是否在正常脱保护条件下被过量哌啶等二级胺充分捕获；

         ④脱保护后洗涤是否充分；

         ⑤烯丙氧羰基（Allyloxycarbonyl，Alloc）脱保护时清除剂是否足量；

         ⑥反应体系中是否存在醛类或其他活性烷基化物质。

         需要注意的是，在正常哌啶脱保护条件下，DBF 主要被捕获形成胺加合物；在捕获不足、扩散受限、停留时间异常或洗涤不足时，应重点考虑 DBF 相关加合风险

3.4 批次间杂质差异明显：优先排查溶剂、试剂和操作一致性

         如果同一序列在不同批次中杂质谱差异明显，应优先排查工艺一致性，而不是立即修改整个合成路线。重点检查：

         批次差异通常来自多个小变量叠加。准确记录试剂批号、开封时间、配液时间和关键步骤时长，有助于快速定位问题。

4. 三个容易被忽视的来源

4.1 溶剂状态可能改变合成结果

         DMF 常被视为常规溶剂，但它不是可以无限期稳定使用的惰性背景物质。长期储存、反复开封、接触空气和水分，都可能导致 DMF 质量下降。对长肽、难偶联序列或对副反应敏感的序列，新鲜 DMF 的重要性不低于偶联试剂选择。

4.2 洗涤效率决定残留试剂是否进入下一步

许多氨基副反应不是主反应本身造成的，而是上一步活性物质残留到下一步后造成的。尤其在树脂溶胀不足、序列疏水性强或树脂载量偏高时，洗涤不充分会明显增加副反应风险。重点洗涤节点包括：

         ①Fmoc 脱保护后；

         ②偶联反应后；

         ③封端反应后；

         ④切割前树脂预处理；

         ⑤使用特殊保护基或金属催化脱保护后。

         洗涤步骤不应仅作为固定流程执行，而应根据序列难度、树脂性质和试剂残留风险进行调整。

4.3 序列中的敏感位点会放大副反应风险

         多肽合成具有明显序列依赖性。同样的合成方法，对不同序列可能产生完全不同的杂质谱。需要重点关注的残基包括：

         其中，Met 氧化、Asn/Gln 脱酰胺和 Asp 相关异构化不属于典型氨基副反应，但在实际杂质排查中经常与氨基副反应同时出现。

5. 推荐排查流程

5.1 先确认异常峰是否为肽相关杂质

第一步不是直接判断副反应，而是确认异常峰是否来自多肽本身。建议检查：

         ①空白进样是否有相同峰；

         ②粗肽 HPLC 和 LC-MS 是否同时出现该峰；

         ③目标峰和杂质峰是否具有合理的紫外吸收；

         ④杂质峰是否有明确肽相关分子量；

         ⑤更换流动相或色谱条件后，异常峰是否仍然存在。

         如果异常峰没有明确肽相关质量，应先排除盐、溶剂、塑化剂、缓冲盐残留或仪器背景。

5.2 再用质量变化缩小副反应范围

         LC-MS 提供的质量变化可用于初步判断修饰类型，但不能单独作为最终定性依据。对于关键杂质，应结合 MS/MS 定位修饰位点。常见判断方向如下：

5.3 最后结合合成记录定位步骤

质量信息须与合成记录对应起来，才能判断杂质来源。建议按以下顺序定位：

         ①杂质对应的质量变化是什么；

         ②该修饰可能发生在哪类官能团上；

         ③序列中是否存在相应高风险位点；

         ④合成过程中哪一步最可能提供反应条件；

         ⑤是否存在试剂残留、洗涤不足或处理时间过长；

         ⑥是否需要小规模对照实验验证。

示例判断：

         ①如果出现乙酰化截短肽，优先检查偶联不完全和封端步骤；

         ②如果出现甲酰化相关修饰，优先检查 DMF 状态、甲酸使用和活化体系；

         ③如果出现 N-烷基化相关杂质，优先检查脱保护副产物清除和洗涤；

         ④如果纯化后杂质增加，优先检查酸性流动相、放置时间和冻干过程。

6. 降低氨基副反应风险的工艺建议

6.1 合成前进行序列风险评估

合成前应先分析序列长度、疏水性、空间位阻残基、带电残基分布和敏感残基。对于长肽、疏水肽、聚集倾向强的序列，应提前考虑：

         ①是否降低树脂载量；

         ②是否采用双偶联；

         ③是否使用更适合的偶联试剂；

         ④是否需要改变保护基策略；

         ⑤是否优化切割体系和清除剂组合。

         序列风险评估可以减少后续盲目优化，提高问题定位效率。

6.2 控制游离氨基暴露时间

游离氨基是肽链延伸的必要中间状态，但暴露时间过长会增加副反应概率。尤其在脱保护后、封端前或洗涤不足时，游离氨基更容易接触残留活性物质。建议做到：

         ①脱保护后及时洗涤；

         ②洗涤后尽快进入偶联；

         ③避免树脂长时间浸泡在脱保护液中；

         ④减少自动合成程序中的非必要停留；

         ⑤对难合成序列优化洗涤体积和洗涤次数。

6.3 管理关键试剂和溶剂

         多肽合成对试剂状态敏感，尤其是 DMF、TFA、哌啶、缩合剂、碱、乙酸酐和清除剂。建议建立基本试剂管理表。

6.4 建立异常杂质记录表

多肽合成问题具有明显经验积累价值。建议每次异常杂质分析后，记录以下信息：

         ①多肽序列；

         ②树脂类型和载量；

         ③氨基酸保护基；

         ④偶联试剂和添加剂；

         ⑤脱保护条件；

         ⑥是否封端；

         ⑦切割体系和时间；

         ⑧粗肽 HPLC 纯度；

         ⑨LC-MS 主要杂质质量；

         ⑩纯化条件；

7. 多肽合成异常杂质排查相关代表化学品分类表

表1. 合成溶剂、沉淀洗涤与纯化相关试剂

表2. 脱保护、酸处理、封端与副反应相关试剂

表3. 偶联试剂与偶联添加剂

表4. 保护基引入与保护策略相关试剂

表5. 切割清除剂与侧链副反应控制试剂

         注：以上为阿拉丁代表产品，更多产品规格可用‘品名/CAS/货号’在阿拉丁官网检索。

参考文献

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