血液寄生虫显微检测的关键在于同时获得检出率和形态鉴别信息。厚血膜适合提高低虫血症样本检出率，薄血膜适合观察虫体形态、宿主红细胞变化和虫种特征；Giemsa、Wright-Giemsa、快速Romanowsky染色和荧光染色体系应根据检测对象、样本量、实验通量和鉴定深度选择。

关键词：血液寄生虫；厚血膜；薄血膜；Giemsa染色；Wright-Giemsa染色；疟原虫；巴贝虫；微丝蚴

1 血液寄生虫显微检测的基本逻辑

1.1 检测对象与染色目标

（1）疟原虫

        疟原虫显微检测重点包括环状体、滋养体、裂殖体、配子体、感染红细胞形态、Schüffner点、Maurer斑点和虫体色素。厚血膜用于提高检出率，薄血膜用于虫种鉴别和寄生率计算。Giemsa染色仍是形态学观察中最常用的基础体系。

（2）巴贝虫

        巴贝虫主要寄生于红细胞内，常表现为环状体、梨形体或四联体样结构。其形态可与疟原虫环状体相似，薄血膜对红细胞内虫体排列方式和色素缺如的观察更重要。判读时应结合红细胞形态、虫体数量和临床背景。

（3）锥虫

        锥虫常以血液中活动或固定后的鞭毛体形式出现，观察重点包括虫体长度、波动膜、鞭毛、动基体、细胞核位置和体态弯曲。Giemsa或Wright-Giemsa染色可显示核质和胞质结构，湿片可用于活动性初筛。

（4）微丝蚴

        微丝蚴检测关注虫体大小、鞘膜有无、头端间隙、体核排列和尾端核分布。厚血膜、浓集法和特定苏木素类染色可用于提高检出率和显示结构细节。不同虫种的采血时间具有差异，应根据周期性选择取样时间。

表1 血液寄生虫显微检测对象与推荐染色体系

1.2 厚血膜与薄血膜分工

（1）厚血膜

        厚血膜通过浓缩较大体积血液提高检出率，适合低虫血症、筛查和随访检测。红细胞在染色前后被溶解或脱血红蛋白，虫体集中于较小视野范围内，但红细胞形态丢失，虫种鉴别能力弱于薄血膜。

（2）薄血膜

        薄血膜保留红细胞形态和虫体空间关系，适合虫种鉴别、寄生率计算和红细胞内寄生虫结构观察。样本中虫体数量较低时，薄血膜检出率可能不足，因此常与厚血膜并行。

（3）组合使用

        常规血液寄生虫显微检测不宜只依赖一种血膜。厚血膜用于发现虫体，薄血膜用于确认虫种、虫体阶段和感染细胞特征；两者结果不一致时，应优先检查制片质量、染色条件和观察视野数量。

2 Giemsa染色体系

2.1 适用场景

（1）疟原虫检测

        Giemsa染色适合厚血膜和薄血膜，是疟原虫显微检测的核心方法。环状体、滋养体、裂殖体和配子体可形成较稳定的蓝紫色核质与淡蓝色胞质对比，红细胞内细小结构也较易识别。

（2）巴贝虫检测

        Giemsa染色可显示巴贝虫红细胞内环状体和梨形体。与疟原虫相比，巴贝虫通常缺乏疟色素，红细胞改变相对不同，薄血膜中虫体形态和排列方式更有鉴别价值。

（3）锥虫和微丝蚴观察

        Giemsa染色可用于血液锥虫和微丝蚴形态观察。锥虫可显示细胞核、动基体和波动膜轮廓；微丝蚴可观察鞘膜和体核排列，但某些微丝蚴结构显示可能需要专用染色或浓集法补充。

2.2 染色要点

（1）缓冲液pH

        Giemsa染色对缓冲液pH敏感。血液寄生虫观察通常要求接近中性至微碱性的缓冲条件，pH偏低可导致整体偏红，pH偏高可导致背景偏蓝或沉淀增加。疟原虫细胞核、胞质和红细胞颗粒的颜色平衡依赖稳定pH。

（2）染色时间

        厚血膜通常需要较长染色时间以保证虫体着色充分，薄血膜可根据染液浓度采用较短或中等染色时间。快速缩短染色时间可能造成虫体核质不清，过度延长则容易增加背景和沉淀。

（3）固定差异

        薄血膜通常需甲醇固定，以保持红细胞形态和虫体位置；厚血膜通常不进行甲醇固定，以便红细胞脱血红蛋白。若厚血膜误固定，红细胞难以溶解，会显著降低镜检质量。

2.3 判读重点

（1）厚血膜判读

        厚血膜中应重点寻找染色清晰的虫体核质、胞质和色素样结构。由于红细胞形态丢失，虫种鉴别应谨慎，阳性后需结合薄血膜确认。

（2）薄血膜判读

        薄血膜应观察感染红细胞大小、形态、虫体数量、虫体阶段、色素、点彩和寄生率。疟原虫虫种鉴别尤其依赖薄血膜中红细胞改变和虫体发育阶段组合。

（3）低虫血症样本

        低虫血症样本应增加厚血膜观察视野数量，并重复采样或复查。单张阴性涂片不能完全排除早期或低水平感染，尤其在临床高度怀疑时。

表2 Giemsa染色中厚血膜与薄血膜比较

3 Wright-Giemsa与快速Romanowsky染色

3.1 Wright-Giemsa染色

（1）适用场景

        Wright-Giemsa染色常用于血液涂片和骨髓涂片，可同时显示血细胞形态和寄生虫结构。对于疟原虫、巴贝虫、锥虫、微丝蚴以及骨髓或组织涂片中的利什曼原虫，该体系具有较好的通用性。

（2）技术特点

        Wright-Giemsa染色兼顾血细胞形态学和寄生虫观察，可在临床血液学实验室中与常规血涂片检测衔接。其优势是操作体系成熟、背景细胞信息丰富；不足是厚血膜敏感性和疟原虫细微点彩显示可能受染色条件影响。

（3）判读重点

        使用Wright-Giemsa时，应关注虫体核质对比、胞质边界、宿主细胞背景和染色均一性。血细胞过深或背景偏蓝会降低小型环状体检出率，应通过缓冲液pH、染色时间和冲洗方式优化。

3.2 快速Romanowsky染色

（1）适用场景

        快速Romanowsky染色适合急诊筛查、现场检测和快速涂片判断，如Diff-Quik类染色体系。它可较快显示血细胞和部分血液寄生虫结构，但在低虫血症和精细虫种鉴别方面不宜完全替代标准Giemsa染色。

（2）技术特点

        快速染色流程短、通量高，对设备要求较低，适合初筛和形态快速确认。其染色层次通常不如标准Giemsa稳定，细小点彩、微弱胞质和低丰度虫体可能不够清晰。

（3）判读重点

        快速染色阳性结果应结合标准Giemsa或薄血膜复核；快速染色阴性但临床疑似度高时，应增加厚血膜、重复采样或采用分子检测。对于巴贝虫和疟原虫环状体鉴别，薄血膜标准染色仍更可靠。

3.3 方法选择

（1）常规实验室

        常规实验室建议以Giemsa染色厚血膜和薄血膜作为基础组合，Wright-Giemsa可作为血液学涂片和骨髓涂片补充方法。

（2）急诊和现场筛查

        急诊或现场筛查可采用快速Romanowsky染色提高周转速度，但阳性样本和疑难样本应进行标准染色复核。

（3）科研和药效评价

        科研场景中若需要寄生率、虫体阶段比例或药物作用后形态变化分析，应优先选择标准化Giemsa薄血膜，并统一染色时间、pH和计数规则。

表3 Romanowsky类染色体系比较

4 荧光染色与浓集检测

4.1 荧光染色

（1）适用场景

        荧光染色可用于提高低丰度血液寄生虫检出效率，尤其适合筛查场景。吖啶橙、QBC相关体系或核酸荧光染料可使虫体核酸信号更突出，便于快速扫描。

（2）判读特点

        荧光法显示的是核酸或特定染料结合信号，检出效率较高，但形态鉴别能力通常不如标准薄血膜染色。阳性信号应结合形态学复核，尤其需要区分血小板、白细胞碎片和染料沉淀。

（3）控制要点

        荧光染色需控制染料浓度、孵育时间、背景荧光和显微镜参数。若用于随访或药效评价，应统一曝光和判读标准，避免把背景荧光变化误判为虫体数量变化。

4.2 浓集法

（1）微丝蚴浓集

        微丝蚴数量较低时，可采用浓集法提高检出率。浓集后再进行染色，有利于观察体核、鞘膜和尾端核分布。采血时间应与微丝蚴周期性相匹配。

（2）疟原虫低虫血症

        疟原虫低虫血症样本仍以厚血膜多视野观察为基础。荧光筛查或分子检测可作为补充，但形态学分期和虫种特征仍需要薄血膜支持。

（3）血液沉渣和白膜层

        某些血液寄生虫可在白膜层或浓集层中更易检出。此类方法可提高敏感性，但形态可能受离心和处理步骤影响，应与常规涂片结果结合解释。

表4 荧光和浓集方法在血液寄生虫检测中的应用

5 不同血液寄生虫的判读要点

5.1 疟原虫

（1）环状体

        环状体常表现为细胞核点状或小团块状，胞质呈环形或细弧形。恶性疟原虫可见多重感染红细胞和边缘型环状体，薄血膜对这些特征判读更重要。

（2）滋养体和裂殖体

        滋养体和裂殖体可提供虫种鉴别信息。间日疟原虫感染红细胞常增大并可见Schüffner点；恶性疟原虫外周血中成熟阶段较少见，出现大量成熟滋养体或裂殖体需结合病情判断。

（3）配子体

        恶性疟原虫配子体常呈新月形或香蕉形，是重要形态特征。其他疟原虫配子体形态不同，应结合感染红细胞大小、点彩和虫体色素综合判断。

5.2 巴贝虫

（1）红细胞内形态

        巴贝虫可呈环状、梨形、成对或四联体样排列。其与疟原虫相似之处在于均可见红细胞内环状结构，但巴贝虫通常无疟色素，红细胞内特征性点彩不典型。

（2）鉴别要点

        薄血膜中若见四联体样结构，可提示巴贝虫可能，但该结构并非所有样本均出现。鉴别时应结合旅行史、蜱暴露史、溶血表现和必要的分子检测。

（3）计数方式

        巴贝虫感染程度可通过薄血膜估算感染红细胞比例。低感染水平时应增加观察红细胞数量，避免因单一区域涂片不均导致偏差。

5.3 锥虫与微丝蚴

（1）锥虫

        锥虫血涂片中可见细长虫体、波动膜、鞭毛、细胞核和动基体。新鲜湿片可观察运动性，染色涂片可进行结构确认。虫体形态受干燥、固定和涂片压力影响明显。

（2）微丝蚴

        微丝蚴应观察虫体长度、鞘膜、头端间隙、体核排列和尾端核有无。厚血膜可提高检出率，但虫体可能弯曲或重叠；薄血膜和专用染色可补充结构细节。

（3）采血时间

        部分微丝蚴具有夜现或昼现周期性，采血时间直接影响检出率。阴性结果应结合采血时间、临床表现和流行病学信息解释。

表5 主要血液寄生虫形态学判读重点

6 制片、染色与镜检质量控制

6.1 采血与样本保存

（1）采血时间

        疟原虫检测可根据发热周期和临床疑似度安排重复采样；微丝蚴检测应根据虫种周期性选择夜间或白天采血。采血时间记录对阴性结果解释非常关键。

（2）抗凝剂影响

        EDTA抗凝血可用于涂片制备，但长时间放置会影响寄生虫形态和红细胞结构。血液样本应尽快制片，延迟处理会增加形态退变和染色异常。

（3）涂片数量

        疑似血液寄生虫感染时，建议同时制备厚血膜和薄血膜，并保留备用涂片。低虫血症样本可增加涂片数量和观察时间。

6.2 血膜制备

（1）厚血膜

        厚血膜应厚薄适中，干燥充分后再染色。血膜过厚会脱血红蛋白不完全，背景深；血膜过薄则失去浓缩优势。干燥不足时染色易脱片。

（2）薄血膜

        薄血膜应形成均匀羽状边缘，最佳观察区域为红细胞单层且轻微接触的区域。过厚区域红细胞重叠，过薄区域细胞变形，均不利于虫体判读。

（3）固定控制

        薄血膜甲醇固定时间应稳定，厚血膜不应甲醇固定。固定混淆是血液寄生虫染色中常见错误，会直接影响检出率和形态质量。

6.3 镜检与报告

（1）观察视野

        厚血膜阴性判定应满足足够视野数量或白细胞计数范围。薄血膜寄生率计算应明确计数红细胞数量或视野规则。

（2）阳性报告

        阳性报告应包括寄生虫类型、虫体阶段、寄生率或半定量结果。若只能确定血液寄生虫阳性而不能明确虫种，应如实报告“疑似”并建议复核。

（3）复核机制

        低虫血症、形态不典型、治疗后样本和疑似混合感染均应由有经验人员复核。必要时联用快速抗原、分子检测或血清学方法。

表6 常见染色问题与优化方向

7 血液寄生虫显微检测染色相关试剂选型

表7 血液寄生虫显微检测染色相关试剂选型

8 常见问题

8.1 血液寄生虫检测为什么要同时做厚血膜和薄血膜？

        厚血膜提高检出率，适合低虫血症筛查；薄血膜保留红细胞形态，适合虫种鉴别和寄生率计算。两者功能不同，并行使用可同时提高敏感性和判读准确性。

8.2 Giemsa染色和Wright-Giemsa染色哪个更适合疟原虫？

        标准Giemsa染色更适合疟原虫厚血膜和薄血膜检测，尤其适合虫体阶段和红细胞改变观察。Wright-Giemsa可用于血液学背景下的薄血膜观察，但疑难样本仍建议用标准Giemsa复核。

8.3 快速染色阴性可以排除疟疾吗？

        不能。快速Romanowsky染色适合初筛，但低虫血症、早期感染或涂片质量不佳时可能漏检。临床疑似度高时，应进行厚血膜标准Giemsa染色、重复采样或分子检测。

8.4 巴贝虫和疟原虫如何在血涂片中区分？

        两者均可出现红细胞内环状体。巴贝虫通常无疟色素，可见梨形体或四联体样结构；疟原虫常可结合虫体阶段、色素、红细胞改变和点彩进行判断。形态不典型时需结合流行病学和分子检测。

8.5 微丝蚴检测为什么强调采血时间？

        部分微丝蚴在外周血中具有周期性，夜间或白天出现密度不同。采血时间不匹配可能导致假阴性。检测前应根据疑似虫种和流行区特点安排采血时间。

8.6 厚血膜为什么不能甲醇固定？

        厚血膜需要红细胞溶解或脱血红蛋白，以便寄生虫集中显示。甲醇固定会保留红细胞结构，影响脱血红蛋白过程，使背景过厚并降低虫体可见性。

8.7 显微镜阴性但临床高度怀疑怎么办？

        应复查厚血膜和薄血膜，增加观察视野或重复采血。若仍阴性，可结合快速抗原检测、PCR或其他分子方法。显微镜结果应与发热周期、旅行史、蜱叮咬史、贫血和血小板变化综合判断。

        血液寄生虫显微检测应以标准化血膜制备和Romanowsky类染色为基础。厚血膜解决检出率问题，薄血膜解决形态鉴别问题；Giemsa染色适合常规确证，Wright-Giemsa和快速染色适合补充场景，荧光和浓集方法则用于低丰度或快速筛查样本。

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[1] 姬姆萨（Giemsa）染色实验Protocol：血液涂片与骨髓涂片