无细胞蛋白合成系统（cell-free protein synthesis，CFPS）是在体外条件下利用细胞裂解物或重构翻译体系，以DNA、PCR产物或mRNA为模板合成目标蛋白的反应平台。该系统脱离细胞生长、转化筛选和宿主毒性限制，适合用于毒性蛋白、膜蛋白、难表达蛋白、非天然氨基酸掺入、快速蛋白筛选、合成生物学线路验证和小规模功能验证。

关键词：无细胞蛋白合成；CFPS；体外翻译；细胞裂解物；PURE系统；膜蛋白表达；非天然氨基酸；蛋白质快速筛选

1 无细胞蛋白合成系统的基本构成

1.1 反应体系组成

（1）遗传模板

        CFPS可使用质粒DNA、线性DNA、PCR产物或mRNA作为模板。质粒DNA稳定性较好，适合常规表达和方法优化；PCR产物无需克隆，适合高通量筛选和突变体快速验证；mRNA模板可绕过转录步骤，适合分析翻译效率和mRNA结构对蛋白产量的影响。线性DNA和PCR模板容易被核酸酶降解，通常需要优化端保护结构或加入核酸酶抑制策略。

（2）转录与翻译机器

        以DNA为模板的CFPS需要RNA聚合酶完成转录，并依赖核糖体、tRNA、氨酰-tRNA合成酶、起始因子、延伸因子和终止因子完成翻译。细胞裂解物体系通常保留这些组分，操作相对简便；重构体系则使用纯化组分重新组装，背景更低，体系更可控，但成本和组分优化要求更高。

（3）底物与能量系统

        蛋白质合成需要20种氨基酸、ATP、GTP、核苷酸、镁离子、钾离子、缓冲组分和能量再生体系。常用能量底物包括磷酸烯醇式丙酮酸、肌酸磷酸、3-磷酸甘油酸、麦芽糊精或葡萄糖相关体系。能量系统不仅影响产量，还会改变pH、无机磷酸盐积累和镁离子有效浓度，从而影响翻译持续时间。

（4）辅助因子与反应环境

        镁离子、钾离子、二硫键形成环境、分子伴侣、去污剂、脂质体、纳米盘和膜模拟体系会影响蛋白折叠、溶解性和活性。表达可溶性酶、膜蛋白、含二硫键蛋白或含非天然氨基酸蛋白时，体系组成不应直接套用同一条件。

表1 无细胞蛋白合成系统的核心组分与实验作用

1.2 主要体系类型

（1）大肠杆菌裂解物体系

        大肠杆菌裂解物体系反应速度快、产量较高、成本相对低，适合原核蛋白、酶类、筛选型表达和高通量优化。其限制主要在于缺乏真核翻译后修饰能力，对复杂二硫键蛋白、糖基化蛋白和部分膜蛋白需要额外体系工程或反应条件优化。

（2）小麦胚芽体系

        小麦胚芽体系属于真核来源体系，适合表达部分真核蛋白、蛋白复合物和对原核体系不友好的目标蛋白。该体系背景核酸酶和蛋白酶活性较低，蛋白折叠环境相对温和，但反应速度和成本通常与大肠杆菌体系不同，适合用于结构功能研究和真核蛋白筛选。

（3）兔网织红细胞裂解物体系

        兔网织红细胞裂解物体系适合mRNA模板翻译、真核蛋白表达和部分翻译调控研究。该体系含有真核翻译因子和较完整的翻译环境，但对模板设计、mRNA质量和反应背景控制要求较高。

（4）昆虫细胞和哺乳动物细胞裂解物体系

        昆虫细胞、HeLa细胞或其他哺乳动物来源体系更接近复杂真核表达环境，适用于部分膜蛋白、多结构域蛋白、翻译后修饰相关研究和药物靶点蛋白制备。该类体系成本较高，产量、背景和批次一致性需要重点验证。

（5）PURE重构体系

        PURE系统由纯化的核糖体、翻译因子、tRNA、氨酰-tRNA合成酶和能量组分重构而成，组成明确、背景低、可控性强，适合机制研究、正交翻译系统、遗传密码扩展和合成生物学线路构建。其主要限制是成本较高，且对蛋白折叠和复杂修饰支持有限。

表2 常见CFPS体系类型与应用选择

2 CFPS实验设计的关键参数

2.1 模板设计与模板质量

（1）启动子与调控元件

        DNA模板应匹配反应体系所使用的RNA聚合酶。T7启动子常用于大肠杆菌裂解物和PURE体系，模板中还需合理设计核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子和5′/3′非翻译区。真核体系更依赖mRNA帽结构、poly(A)尾或适合翻译起始的UTR设计。

（2）模板形态

        质粒DNA通常稳定性较好，适合标准表达；PCR模板适合快速筛选突变体、结构域边界和标签位置；mRNA模板适合直接评估翻译效率。线性DNA和PCR模板进入裂解物后可能被核酸酶降解，必要时可使用保护序列、核酸酶抑制剂或更适合线性模板的体系。

（3）模板纯度

        盐、乙醇、酚、胍盐、EDTA和蛋白污染可能抑制转录或翻译反应。模板制备后应确认浓度、完整性和纯度，PCR产物尤其需要去除引物、dNTP、聚合酶和缓冲盐残留。

2.2 离子条件与能量再生

（1）镁离子

        镁离子影响核糖体结构、tRNA结合、ATP/GTP利用和核酸稳定性，是CFPS中最敏感的参数之一。镁离子不足会降低翻译效率，过高则可能造成非特异性沉淀或翻译抑制。不同模板、不同能量底物和不同裂解物批次均需要重新优化镁离子浓度。

（2）钾离子

        钾离子影响核糖体活性、蛋白折叠和整体翻译环境。大肠杆菌体系通常对钾盐浓度较敏感，真核体系也需要维持适合翻译机器工作的离子强度。钾离子优化应与镁离子同时考虑，而不是单独调整。

（3）能量底物

        能量再生体系决定反应持续时间和产量。磷酸烯醇式丙酮酸能快速供能，但副产物和无机磷酸盐积累可能影响反应；3-磷酸甘油酸、肌酸磷酸、麦芽糊精或葡萄糖相关系统可用于延长反应或降低成本。选择能量系统时应结合产量、pH稳定性、成本和目标蛋白活性。

2.3 反应模式与检测策略

（1）批式反应

        批式反应操作简单，适合表达条件筛选、模板比较、标签验证和高通量反应。其限制是底物耗尽、产物抑制和副产物积累较快，反应时间通常有限。

（2）连续交换反应

        连续交换体系通过半透膜或分隔结构持续补充底物并移除小分子副产物，可延长反应时间并提高产量。该模式适合产量放大、结构蛋白制备和较长反应时间需求的蛋白合成。

（3）连续流反应

        连续流系统可实现底物流加、反应体积放大和更稳定的体系控制，适合工艺研究和自动化平台开发。其设计重点在于反应器结构、流速、模板稳定性和产物收集效率。

（4）检测策略

        CFPS结果应区分“总表达量”“可溶表达量”和“功能性产物”。荧光蛋白适合快速报告表达能力，SDS-PAGE和Western blot适合检测分子量与表达条带，酶活、结合实验、配体响应或细胞功能实验用于确认蛋白是否具有目标功能。

表3 CFPS关键参数与优化方向

3 CFPS在难表达蛋白与功能蛋白制备中的应用

3.1 毒性蛋白表达

（1）宿主毒性规避

        毒性蛋白在细胞内表达时可能抑制宿主生长、干扰代谢、破坏细胞膜或导致表达菌株不稳定。CFPS不依赖活细胞增殖，可在体外直接合成目标蛋白，减少克隆和诱导表达阶段的宿主选择压力。

（2）表达过程控制

        毒性蛋白表达时应控制反应体积、模板浓度、反应时间和产物暴露风险。若蛋白具有核酸酶、蛋白酶或膜破坏活性，应设置失活突变体、空模板对照和反应后失活步骤，以避免对体系组分和操作者造成影响。

（3）结果验证

        毒性蛋白不宜仅以表达条带判断成功。应结合纯化结果、活性检测、底物特异性和稳定性评价，区分完整表达、降解产物和非特异性聚集。

3.2 膜蛋白表达

（1）膜环境需求

        膜蛋白需要疏水环境维持构象，直接在水相CFPS中表达容易聚集或失活。加入去污剂、脂质体、纳米盘、微粒体膜或人工膜体系，可提高膜蛋白插入、折叠和功能检测的可行性。

（2）体系选择

        大肠杆菌裂解物适合部分原核膜蛋白和快速筛选；小麦胚芽、昆虫细胞或哺乳动物体系更适合部分真核膜蛋白和复杂药物靶点。若目标蛋白需要糖基化、二硫键或膜定位相关修饰，应优先考虑含微粒体膜或真核来源体系。

（3）功能评价

        膜蛋白表达后应检测配体结合、转运活性、受体信号、抗体识别或结构完整性。单纯SDS-PAGE条带不能证明膜蛋白已正确折叠或插入膜环境。

3.3 含二硫键和复杂折叠蛋白

（1）氧化还原条件

        含二硫键蛋白需要合适的氧化还原环境。细胞裂解物中还原性成分可能阻碍二硫键形成，可通过调整谷胱甘肽氧化还原缓冲体系、加入二硫键异构酶或预处理裂解物降低还原背景。

（2）折叠辅助因子

        DsbC、PDI、分子伴侣和脯氨酰异构酶等辅助因子可提高复杂蛋白折叠效率。治疗性蛋白、抗体片段、细胞因子和多二硫键蛋白通常需要将表达量与活性同时评价。

（3）活性检测

        复杂折叠蛋白的评价应优先使用功能检测。对于酶类可检测催化活性，对于受体或结合蛋白可检测配体结合或抗体识别，对于治疗性蛋白可检测细胞功能或靶点响应。

4 CFPS在合成生物学与研发平台中的应用

4.1 非天然氨基酸和遗传密码扩展

（1）正交翻译体系

        CFPS可加入正交tRNA/氨酰-tRNA合成酶对，将非天然氨基酸定点引入目标蛋白。体外体系组成可控，便于调整非天然氨基酸浓度、终止密码子抑制效率和竞争性翻译条件。

（2）特殊蛋白设计

        非天然氨基酸可用于引入荧光基团、交联基团、点击化学位点、光反应基团或稳定化结构。该策略适合蛋白标记、结构解析、药物偶联和功能调控研究。

（3）判读要点

        非天然氨基酸掺入实验需确认全长蛋白比例、错掺率、截短产物和目标位点修饰效率。质谱验证比单纯荧光或条带检测更适合确认定点掺入结果。

4.2 高通量蛋白筛选

（1）模板快速构建

        PCR产物可直接进入CFPS反应，适合结构域边界筛选、突变体库筛选、标签位置比较和蛋白工程早期验证。该模式可减少克隆周期，提高候选蛋白筛选速度。

（2）微孔板反应

        CFPS可在微孔板中进行小体积反应，适合通量化测试表达量、可溶性、酶活、荧光信号或结合能力。反应体系缩小后应重新确认蒸发、边缘效应和移液误差。

（3）数据筛选

        高通量结果应设置阳性模板、阴性模板、空模板和体系背景对照。表达量高但功能低的候选体可能存在折叠问题；表达量低但活性高的候选体可能更适合后续放大优化。

4.3 基因线路与生物传感器验证

（1）基因线路原型构建

        CFPS可用于在体外快速验证启动子、RBS、核糖开关、转录因子和反馈回路。由于体系不含细胞生长和代谢适应过程，适合分析线路本身的响应逻辑。

（2）生物传感器

        将转录/翻译系统与小分子响应元件结合，可构建体外生物传感器。该类系统可用于环境检测、代谢物筛查、病原相关信号检测和现场快速检测平台。

（3）边界条件

        体外线路结果不一定完全等同于细胞内结果。进入细胞后，质粒拷贝数、资源竞争、代谢状态、蛋白降解和细胞生长会改变线路行为，因此CFPS更适合作为原型验证和参数筛选平台。

表4 CFPS应用场景与实验评价指标

5 CFPS结果判读与常见问题

5.1 表达量低

（1）模板问题

        模板浓度不足、启动子不匹配、RBS或UTR设计不合理、PCR残留抑制物过多均会导致表达量低。可通过更换模板形态、优化5′端序列、提高模板纯度和设置阳性模板判断问题来源。

（2）体系活性不足

        细胞裂解物批次差异、冻融次数过多、核糖体活性下降或能量系统失衡会影响表达。应设置标准报告蛋白作为体系质量对照，并避免将体系失活误判为目标蛋白难表达。

（3）反应条件不匹配

        镁离子、钾离子、温度、反应时间和能量底物不匹配均可能降低产量。优化时应优先建立小矩阵，而不是一次只改变一个参数后直接判断体系失败。

5.2 蛋白不可溶或无活性

（1）折叠不足

        目标蛋白表达后可能形成聚集体或错误折叠。可通过降低反应温度、延长反应时间、加入分子伴侣、优化氧化还原环境或更换真核体系改善折叠。

（2）缺少修饰

        糖基化、磷酸化、二硫键、脂质修饰或膜插入对于部分蛋白功能至关重要。缺少这些修饰时，即使表达量较高，蛋白仍可能无活性。此类目标应选择更适合的真核裂解物、微粒体膜体系或后续体外修饰策略。

（3）检测方法不匹配

        部分蛋白对标签位置、缓冲液、辅因子或底物条件敏感。活性检测阴性时，应排除检测体系本身不适配、辅因子不足或标签干扰等因素。

5.3 背景高或重复性差

（1）内源性背景

        裂解物中可能存在内源蛋白、核酸和代谢物背景。检测低表达蛋白或弱活性蛋白时，应设置空模板对照、无模板对照和非相关模板对照。

（2）反应体系波动

        微量反应易受移液误差、蒸发和边缘效应影响。高通量实验中应使用重复孔、随机化布局和板内标准品控制批间差异。

（3）产物降解

        蛋白酶活性、核酸酶活性或目标蛋白自身不稳定会导致产物降解。可加入蛋白酶抑制剂、优化反应时间、降低温度或更换裂解物来源。

表5 CFPS常见问题与优化方向

6 相关产品与材料选型

表6 无细胞蛋白合成系统相关产品与材料

7 常见问题

7.1 无细胞蛋白合成系统适合替代所有细胞表达系统吗？

        不适合。CFPS适合快速表达、难表达蛋白筛选、毒性蛋白、膜蛋白、非天然氨基酸掺入和合成生物学原型验证。若目标是低成本大规模生产、复杂翻译后修饰或稳定分泌表达，仍需根据蛋白类型比较细胞表达系统和CFPS系统的成本与功能优势。

7.2 DNA模板和mRNA模板应该如何选择？

        DNA模板适合转录-翻译偶联反应，操作方便，常用于大肠杆菌裂解物和PURE体系。mRNA模板适合直接研究翻译效率和真核翻译调控，但对RNA完整性和RNase污染更敏感。高通量筛选可优先考虑PCR模板，产量优化可优先使用质粒模板。

7.3 PCR产物能否直接用于CFPS反应？

        可以，但需要满足启动子、翻译起始元件和终止结构完整，同时控制PCR残留物对体系的抑制。线性PCR模板易受核酸酶降解，必要时应增加保护序列、提高模板纯度或选择更适合线性模板的体系。

7.4 CFPS表达膜蛋白时为什么需要脂质体或纳米盘？

        膜蛋白含有疏水跨膜结构，在水相中容易聚集或错误折叠。脂质体、纳米盘、去污剂或微粒体膜可提供膜模拟环境，提高膜蛋白插入、稳定和功能检测的可能性。

7.5 含二硫键蛋白在CFPS中为什么容易无活性？

        二硫键形成需要合适的氧化还原环境和折叠辅助因子。若裂解物还原性过强或缺少DsbC、PDI等折叠酶，蛋白可能表达但不具备正确构象。此类蛋白应同时检测表达量和功能活性。

7.6 CFPS为什么适合非天然氨基酸掺入？

        CFPS体系开放、可控，便于加入非天然氨基酸、正交tRNA和氨酰-tRNA合成酶，并可调节浓度和反应条件。与细胞体系相比，体外体系更容易避免非天然氨基酸摄取、毒性和代谢干扰问题。

        无细胞蛋白合成系统的价值在于将转录、翻译和蛋白功能验证从细胞生长限制中分离出来。对于毒性蛋白、膜蛋白、复杂折叠蛋白、非天然氨基酸蛋白和高通量筛选任务，CFPS能够显著缩短设计—表达—检测周期。