Romanowsky染色是一类以酸性染料伊红和碱性噻嗪类染料为核心的复合染色体系，主要用于血液涂片、骨髓涂片、寄生虫形态、细胞学涂片及部分微生物相关形态观察。其价值不只在于显示细胞核与胞质颜色差异，更在于通过Romanowsky效应呈现细胞核染色质、胞质颗粒、血红蛋白、血小板颗粒和病原体结构之间的层次差异。

        关键词：Romanowsky染色；瑞氏染色；姬姆萨染色；瑞氏-姬姆萨染色；May-Grünwald-Giemsa染色；Diff-Quik染色；血液涂片；骨髓涂片；细胞形态学；Romanowsky效应

1、Romanowsky染色的基本逻辑

1.1 染色体系的组成

（1）酸性染料

        Romanowsky类染色体系中的典型酸性染料为伊红Y。伊红主要与细胞内带正电或碱性成分结合，使红细胞、嗜酸性颗粒、部分胞质蛋白和血红蛋白相关结构呈橙红色、粉红色或红色。

（2）碱性染料

        碱性染料主要为亚甲蓝及其氧化产物，如天青A、天青B、天青C等。此类染料与核酸、核蛋白、核糖体和部分酸性颗粒成分结合，使细胞核、胞质RNA和嗜碱性结构呈蓝紫色或紫红色。

（3）复合显色效应

        Romanowsky染色的典型颜色并不是单一染料简单叠加，而是伊红与天青类染料共同作用形成的多色显色结果。细胞核染色质常呈紫红至紫蓝色，红细胞呈橙红或粉红色，血小板颗粒呈紫红色，中性粒细胞颗粒呈淡紫或粉紫色。

1.2 Romanowsky效应

（1）核心含义

        Romanowsky效应是指天青类碱性染料与伊红共同作用后，使某些细胞结构呈现特征性紫红、紫蓝或粉紫色的现象。细胞核染色质、疟原虫核质、血小板颗粒和白细胞特异颗粒的清晰显示均依赖这一效应。

（2）形成条件

        Romanowsky效应受染料组成、染液成熟度、缓冲液pH、染色时间、涂片厚度和固定状态共同影响。天青B和伊红之间的比例、染液氧化程度及缓冲体系稳定性，是决定染色质量的重要因素。

（3）判读价值

        Romanowsky效应良好时，细胞核染色质颗粒清晰，核质边界明确，红细胞背景均一，白细胞颗粒可分辨。效应不足时，核染偏淡、颗粒不清或整体偏蓝；效应过强或pH偏高时，背景易偏蓝紫，红细胞色调异常。

表1 Romanowsky染色体系的主要显色对象

2、主要Romanowsky染色方法

2.1 瑞氏染色

（1）方法特点

        瑞氏染色以甲醇固定和染色液复合染色为特点，常用于外周血涂片和骨髓涂片。染色液中的甲醇可同时发挥固定作用，因此操作简便，适合常规血细胞形态观察。

（2）染色表现

        瑞氏染色下，红细胞通常呈粉红或橙红色，白细胞核呈紫红色至紫蓝色，粒细胞颗粒分辨较好。中性粒细胞颗粒呈细小淡紫色，嗜酸性颗粒呈橙红色，嗜碱性颗粒呈深蓝紫色。

（3）应用重点

        瑞氏染色适合血常规显微复核、白细胞分类、血小板形态观察、贫血形态学判断及部分血液系统疾病初筛。其优点是操作快速、细胞轮廓清楚，但对缓冲液pH和染色时间较敏感。

2.2 姬姆萨染色

（1）方法特点

        姬姆萨染色中天青类染料比例相对突出，核染和病原体显示能力较强。该方法常用于血液寄生虫、骨髓细胞、细胞遗传学和部分微生物形态观察。

（2）染色表现

        姬姆萨染色可使细胞核染色质呈清晰紫红或紫蓝色，寄生虫核质结构显示较好。红细胞背景相对柔和，部分胞质细节和核结构层次较突出。

（3）应用重点

        姬姆萨染色常用于疟原虫、利什曼原虫、锥虫等寄生虫检查，也用于骨髓涂片和细胞学样本。与瑞氏染色相比，姬姆萨染色在寄生虫和核染色质显示方面更具优势，但染色流程通常更依赖固定和缓冲条件。

2.3 瑞氏-姬姆萨染色

（1）方法特点

        瑞氏-姬姆萨染色结合了瑞氏染色的快速性和姬姆萨染色的核染优势，是血液学和骨髓细胞学中常用的综合染色体系。其目的在于同时获得较好的红细胞背景、白细胞核染色质和胞质颗粒显示效果。

（2）染色表现

        该方法可较好显示红细胞、白细胞、血小板、原始细胞、幼稚细胞及异常细胞。细胞核结构清楚，胞质层次较丰富，颗粒细节较易观察。

（3）应用重点

        瑞氏-姬姆萨染色适合外周血涂片复核、骨髓细胞形态学检查、白血病细胞形态观察、贫血和血小板疾病的形态分析。实际判读中应结合涂片质量和染色均一性判断结果可靠性。

2.4 May-Grünwald-Giemsa染色

（1）方法特点

        May-Grünwald-Giemsa染色常用于血液涂片、骨髓涂片和细胞学样本。May-Grünwald染液主要提供初步固定和细胞质背景染色，Giemsa染液进一步增强核染色和细胞细节。

（2）染色表现

        该法细胞层次丰富，核质对比清晰，适合观察血细胞成熟阶段、胞质颗粒、核染色质和部分异常细胞形态。对于细胞学涂片，背景结构和细胞轮廓较容易保留。

（3）应用重点

        May-Grünwald-Giemsa染色常用于血液学、细胞学和寄生虫学样本，尤其适合需要较完整细胞形态和较清晰核质对比的样本。

2.5 Leishman染色与快速Romanowsky染色

（1）Leishman染色

        Leishman染色也是Romanowsky类染色方法，常用于血涂片和寄生虫检查。其染色液含甲醇，可兼具固定作用，操作相对简化。

（2）Diff-Quik染色

        Diff-Quik属于快速Romanowsky类染色方法，通常包括固定液、酸性染液和碱性染液三步。其优点是速度快，常用于细胞学快速评价、穿刺涂片和床旁快速形态观察。

（3）应用边界

        快速染色适合初步观察和现场评估，但细节层次通常不如规范瑞氏-姬姆萨或May-Grünwald-Giemsa染色稳定。对骨髓精细分类、异常细胞识别或寄生虫精细结构判断时，仍需采用标准染色流程复核。

表2 常见Romanowsky染色方法比较

3、样本类型与染色应用

3.1 外周血涂片

（1）红细胞形态

        Romanowsky染色可显示红细胞大小、形态、中央淡染区和染色深浅。小细胞低色素、球形红细胞、靶形红细胞、裂红细胞、泪滴形红细胞和多嗜性红细胞均可通过血涂片观察。

（2）白细胞分类

        白细胞分类依赖核形、核染色质、胞质颜色和颗粒性质。中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞在Romanowsky染色下具有较稳定的形态特征。

（3）血小板观察

        血小板通常呈淡蓝胞质并含紫红色颗粒。Romanowsky染色可用于观察血小板数量估计、聚集、巨大血小板、低颗粒血小板和血小板形态异常。

3.2 骨髓涂片

（1）造血细胞分化

        骨髓涂片中需区分粒系、红系、巨核系、淋巴细胞、浆细胞和单核细胞等。Romanowsky染色可较好显示核染色质成熟、胞质颜色变化和颗粒形成过程。

（2）原始与幼稚细胞识别

        原始细胞通常表现为核染色质细致、核仁明显、胞质量较少或中等。不同系列幼稚细胞的判断需结合核形、胞质嗜碱性、颗粒和细胞大小综合分析。

（3）血液肿瘤形态学

        白血病、骨髓增生异常综合征、浆细胞疾病和骨髓增殖性肿瘤的初步形态判断离不开Romanowsky类染色。异常细胞的核质比例、颗粒异常、核分叶异常和胞质空泡均具有判读价值。

3.3 寄生虫与病原体观察

（1）疟原虫

        Giemsa染色是疟原虫检查中的重要方法。其可显示疟原虫核、胞质、色素颗粒及不同发育阶段结构，用于血涂片薄片和厚片检查。

（2）利什曼原虫与锥虫

        Romanowsky类染色可显示虫体核、动基体和胞质结构。对于寄生虫识别，染色质量、涂片厚薄和显微镜观察经验非常关键。

（3）部分细菌和细胞内病原体

        某些细胞内病原体、包涵体或微小结构可在Romanowsky类染色中呈现提示性形态，但其特异性有限。必要时应结合特殊染色、免疫检测或分子检测确认。

表3 不同样本中的Romanowsky染色应用

4、染色条件对结果的影响

4.1 缓冲液pH

（1）pH偏低

        pH偏低时，染色结果常偏红。红细胞颜色加深，白细胞核和颗粒可能偏淡，细胞核紫蓝色不足，核染色质层次变差。

（2）pH偏高

        pH偏高时，染色结果常偏蓝。红细胞可呈灰蓝或蓝紫色背景，白细胞胞质偏蓝，涂片整体背景加深，影响红细胞和细胞颗粒判读。

（3）适宜范围

        血液涂片Romanowsky染色通常需要弱酸至近中性缓冲环境。不同方法推荐pH略有差异，实际操作应保持缓冲液稳定，避免直接使用pH不明的水源配制染液。

4.2 染液成熟度与配方

（1）染液成熟

        Romanowsky染液中亚甲蓝的氧化产物对显色质量十分重要。染液成熟不足可导致Romanowsky效应不充分；染液过度老化或污染则可造成沉渣、背景升高和颜色失衡。

（2）染料比例

        伊红和天青类染料比例决定核、胞质和颗粒的颜色平衡。伊红过强时红细胞和嗜酸性颗粒显色过重；碱性染料过强时背景偏蓝、核染过深。

（3）染液过滤

        染液沉淀会在涂片上形成颗粒状背景，干扰血小板、细菌、寄生虫或胞质颗粒判断。使用前过滤染液是保证染色质量的重要步骤。

4.3 涂片质量

（1）厚薄均匀

        血涂片应形成合适的单层细胞区。涂片过厚会导致细胞重叠、染色不均和分类困难；涂片过薄则可能细胞分布不足，影响统计代表性。

（2）干燥速度

        涂片应快速自然干燥。干燥过慢可造成红细胞皱缩、白细胞形态变形和背景污染；热风或过度加热可能破坏细胞结构。

（3）固定状态

        固定不足会造成细胞脱落和结构模糊；固定过度可能影响染料进入和颜色表现。含甲醇染液虽可固定，但仍需保证涂片完全干燥后再染色。

表4 Romanowsky染色常见影响因素

5、典型染色结果判读

5.1 红细胞系统

（1）正常红细胞

        正常红细胞在Romanowsky染色中多呈粉红至橙红色，中央淡染区清楚。颜色均一、大小相对一致，是判断染色质量的重要参照。

（2）异常染色表现

        低色素红细胞中央淡染区扩大，嗜多色性红细胞因含RNA成分可呈蓝灰色。红细胞整体偏蓝需先排除pH偏高或染色过度，再判断是否存在真实病理改变。

（3）形态异常

        靶形红细胞、球形红细胞、裂红细胞、泪滴形红细胞、椭圆形红细胞等均可通过血涂片观察。形态判读应选择涂片单层区，避免边缘区和厚片区误判。

5.2 白细胞系统

（1）粒细胞

        中性粒细胞核分叶清晰，胞质颗粒细小淡紫。嗜酸性粒细胞颗粒橙红，嗜碱性粒细胞颗粒深蓝紫，颗粒常可遮盖部分核结构。

（2）淋巴细胞与单核细胞

        小淋巴细胞胞质量少，胞质蓝色，核染色质致密。单核细胞体积较大，核形不规则，胞质灰蓝并可见细小颗粒或空泡。

（3）异常细胞

        原始细胞、异型淋巴细胞、浆细胞样细胞或异常粒细胞需结合核染色质、核仁、胞质量、颗粒和细胞大小综合判断。单一颜色变化不足以确定细胞性质。

5.3 血小板与背景

（1）血小板形态

        血小板多呈小片状或颗粒状紫红结构，分布于红细胞间隙。聚集明显时可能造成自动计数偏低，需要结合涂片复核。

（2）背景沉渣

        染液沉淀、灰尘和玻片污染可模拟血小板、细菌或寄生虫结构。沉渣常大小不一、分布不符合细胞背景，需结合焦平面和形态特征鉴别。

（3）细胞碎片

        细胞碎片可干扰血小板估计和异常细胞判断。涂片制作不良、样本放置过久或抗凝不当均可能增加碎片背景。

表5 Romanowsky染色结果判读要点

6、不同Romanowsky方法的选择

6.1 血液细胞形态分析

（1）常规外周血

        常规外周血涂片可选择瑞氏染色或瑞氏-姬姆萨染色。若重点是白细胞分类、红细胞形态和血小板观察，瑞氏染色已能满足多数形态学需求。

（2）骨髓细胞学

        骨髓涂片更适合使用瑞氏-姬姆萨染色或May-Grünwald-Giemsa染色。骨髓样本细胞类型复杂，需要更好的核质对比和颗粒显示能力。

（3）异常细胞复核

        当存在原始细胞、异常淋巴细胞、浆细胞样细胞或疑似血液肿瘤细胞时，应优先选择染色稳定、层次清晰的方法，并结合细胞化学、流式或分子检测。

6.2 寄生虫与快速细胞学

（1）寄生虫检查

        疟原虫等血液寄生虫检查通常优先选择Giemsa染色。厚血膜适合提高检出率，薄血膜适合虫种形态识别。

（2）快速细胞学评估

        穿刺涂片、体液涂片和细胞学现场评估可采用Diff-Quik等快速Romanowsky染色。该类方法有利于快速判断样本是否充分、是否含有肿瘤细胞或炎症细胞。

（3）精细诊断复核

        快速染色结果用于初筛时，应避免过度解释。对需要精细分型或临床决策的样本，应采用标准染色和必要的辅助检测复核。

表6 Romanowsky染色方法选择建议

7、Romanowsky染色相关产品选型

表7 Romanowsky染色成品试剂、专用染液与组分型产品选型

表8 Romanowsky染色基础染料、缓冲组分与辅助试剂选型

        Romanowsky染色的核心优势在于以一个复合染色体系同时显示细胞核、胞质、颗粒、红细胞背景、血小板和部分病原体结构。瑞氏、姬姆萨、瑞氏-姬姆萨、May-Grünwald-Giemsa和Diff-Quik等方法各有侧重，实际选择应根据样本类型、检测目的和判读精度确定。

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[1] 姬姆萨（Giemsa）染色实验Protocol：血液涂片与骨髓涂片