肿瘤类器官可保留患者肿瘤的部分组织形态、驱动变异和克隆差异，为分析肿瘤演化、治疗敏感性及耐药机制提供可扩增的人体来源模型。

        关键词：肿瘤类器官；患者来源类器官；肿瘤异质性；三维培养；恶性身份鉴定；药物筛选；耐药机制；精准治疗；肿瘤微环境

1 肿瘤类器官模型的生物学基础与技术特征

1.1 恶性克隆与肿瘤类器官形成

        肿瘤类器官通常由患者肿瘤组织中具有持续增殖能力的恶性细胞建立。不同肿瘤细胞对失巢、氧化应激和外源生长信号的耐受性不同，只有部分细胞能够在三维环境中存活并形成腺腔、囊泡、实性团块或分支结构。因此，类器官建系本身就是一次克隆筛选，形成的培养物不一定完整包含原肿瘤中的全部细胞亚群。

1.2 原肿瘤异质性的保留与丢失

        患者来源肿瘤类器官可保留部分组织学特征、驱动突变、拷贝数异常和药物反应差异，但各亚克隆的保留程度受到取材位置、初始细胞比例和培养条件影响。低丰度克隆可能在建系早期丢失，生长较快的亚克隆则可能在连续传代中逐渐占优，因此不能仅凭原组织和类器官共有的少数突变判断异质性被完整保留。

1.3 培养选择压力与亚克隆重塑

        培养基中的Wnt、EGF、FGF、TGF-β通路抑制剂及激素成分会对肿瘤细胞产生选择压力。依赖特定生长信号的克隆可能在相应因子缺失时消失，而获得通路自主性的克隆则可能被富集。类器官长期培养后的组成既反映原肿瘤特征，也反映体外环境下的适应性演化。

1.4 正常上皮细胞的竞争性扩增

        肿瘤组织中通常混有正常腺体、导管或基底细胞，其中部分正常干细胞的类器官形成能力高于恶性细胞。正常细胞可能形成边界规则、薄壁和高度极化的囊性结构，并在常规扩增培养基中快速生长。区分正常与肿瘤类器官必须结合原组织病理、驱动变异、拷贝数异常及培养因子依赖性，不能仅依据三维形态。

1.5 肿瘤微环境的保留边界

        常规肿瘤类器官培养以恶性上皮细胞为主，免疫细胞、成纤维细胞、血管细胞和原有细胞外基质通常会逐渐减少。因此，该模型更适合研究肿瘤细胞内在的生长和药物反应，而不能直接代表完整肿瘤微环境。研究免疫逃逸、间质屏障或血管生成时，需要引入共培养、气液界面、微流控或组织片段培养体系。

2 肿瘤组织取材、解离与三维培养流程

2.1 样本类型与建系价值

        肿瘤类器官可由手术切除组织、内镜活检、粗针穿刺、胸腹水、尿液脱落细胞或转移灶样本建立。大块手术组织便于多区域取材和组织学比较，小型活检更接近临床决策窗口，液体样本则适合获得晚期或难以再次手术患者的肿瘤细胞。不同来源样本的细胞数量、坏死比例和正常细胞污染程度不同，不能采用完全相同的处理强度。

2.2 治疗前后样本的差异

        未经治疗的原发肿瘤通常含有更多治疗敏感克隆，而化疗、靶向治疗或放疗后的样本可能富集耐药亚群，并伴随纤维化、坏死和细胞活率下降。建立纵向类器官模型时，应分别记录取材时间、治疗方案、疗程和临床反应，避免将治疗诱导变化误认为肿瘤固有特征。

2.3 肿瘤含量与取材区域

        类器官建系前应通过病理评估确定肿瘤细胞比例，并尽量避开大片坏死、出血和正常组织区域。对空间异质性明显的肿瘤，可对中心区、浸润前沿、原发灶和转移灶分别建系。将多个区域直接混合虽然有利于提高总体成功率，但会掩盖区域特异的克隆组成和药物反应。

2.4 机械处理与酶解强度

        肿瘤组织可先切割为细小组织块，再根据胶原含量和组织致密程度选择胶原蛋白酶或复合酶体系。纤维化明显的胰腺癌和部分乳腺癌通常需要较充分的基质消化，而脆弱的肺癌、卵巢癌或小型活检样本应减少处理时间。过度单细胞化会增加失巢凋亡并损失细胞间依赖信号，保留小型肿瘤细胞团往往更有利于初代形成。

2.5 正常细胞与非目标细胞控制

        红细胞、脂肪、坏死碎片和过量成纤维细胞会影响基质包埋和成像，但过度富集上皮细胞也可能造成低丰度恶性亚群丢失。可根据癌种采用差速沉降、滤网分级、短期差异贴壁或培养因子选择，但最终仍需通过病理和分子检测确认培养物的肿瘤身份。

2.6 初代接种与建系判断

        细胞团通常包埋于基底膜基质或胶原体系中，并使用与组织来源和分子亚型匹配的培养基。初代培养应连续记录类器官出现时间、形态类型、形成数量和正常结构比例。能够形成三维结构不等于建系成功，只有在连续传代、冻存复苏后仍维持肿瘤特征，才适合作为稳定模型使用。

图1 患者来源肿瘤类器官的样本处理、三维建系与研究应用流程

表1 不同肿瘤样本的建系难点与处理重点

3 细胞外基质、生长因子与小分子化合物的培养调控

3.1 培养基作为肿瘤克隆选择环境

        肿瘤类器官培养基不只是提供营养，还会决定哪些克隆能够持续扩增。强烈依赖外源Wnt、EGF或FGF的细胞在富含相应因子的体系中具有生长优势，而信号自主性较强的恶性克隆可在因子减少后继续扩增。培养配方应根据研究目的在提高建系率和减少克隆选择之间取得平衡。

3.2 生长因子撤除与通路自主性

        部分肿瘤可因APC、CTNNB1、KRAS、EGFR或其他通路异常而降低对外源信号的依赖。逐步撤除Wnt、R-spondin、EGF或其他生长因子，可辅助识别具有通路自主性的克隆，并抑制部分正常细胞生长。但因子非依赖性不是特定基因变异的唯一结果，必须结合基因组和药理学证据判断。

3.3 TGF-β与BMP信号的双重影响

        抑制TGF-β或BMP相关信号可提高部分上皮肿瘤类器官的扩增效率，但也可能改变上皮—间质状态、干性和药物反应。对于SMAD4、TGFBR2或其他通路成员异常的肿瘤，外源抑制剂的作用可能明显减弱。开展通路药物研究时，应避免培养基中长期存在与待测药物作用方向相同的抑制成分。

3.4 基质组成与侵袭表型

        基底膜基质有利于上皮结构形成，而Ⅰ型胶原和硬度可调水凝胶更适合观察细胞迁移、分支和侵袭。基质密度升高还会影响药物扩散和细胞应力信号，使同一类器官在不同基质中的药物敏感性出现差异。因此，药筛实验必须固定基质批次、浓度和包埋体积。

3.5 激素与代谢成分的干扰

        胰岛素、IGF、雌激素、雄激素、糖皮质激素和烟酰胺等成分可直接影响乳腺癌、前列腺癌、肝癌及内分泌相关肿瘤的生长和治疗反应。评价内分泌治疗或代谢抑制剂时，应明确培养基中的激素和营养背景，并采用去除或梯度补充策略区分肿瘤自身依赖与培养条件效应。

3.6 ROCK抑制剂的使用边界

        Y-27632可降低组织解离和复苏后的细胞死亡，适合在初代接种或单细胞传代后的短期窗口使用。持续暴露可能影响细胞骨架、黏附和侵袭行为，进而干扰迁移、力学和药敏实验。涉及这些终点时，应在类器官恢复后撤除ROCK抑制剂。

4 消化系统与泌尿生殖系统肿瘤类器官的培养特征

4.1 结直肠癌类器官

        结直肠癌类器官建系率相对较高，但正常肠上皮也具有较强扩增能力。培养过程中应重点区分正常囊性结构与恶性腺体，并检测原肿瘤共有的APC、KRAS、TP53或SMAD4等异常。该模型特别适合比较原发灶与肝转移灶反应、分析抗EGFR治疗敏感性以及研究化疗后耐药克隆。

4.2 胃癌和食管癌类器官

        胃癌和食管腺癌内部存在明显的组织学及分子亚型差异，统一培养配方可能偏向某些腺体型克隆。模型确认应结合原组织形态、ERBB2扩增、CDH1异常及其他肿瘤特异改变。食管鳞癌类器官则更需关注基底样细胞扩增、角化状态和放化疗反应，不能直接套用腺癌培养体系。

4.3 胰腺癌类器官

        胰腺导管腺癌样本常具有低肿瘤细胞比例和高度纤维化特征，组织解离及正常胰管细胞竞争是主要建系难点。类器官身份应通过KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A等异常与原组织比对。其转化价值集中于化疗组合比较、KRAS通路依赖和癌相关成纤维细胞共培养研究。

4.4 肝癌和胆管癌类器官

        肝细胞癌、肝内胆管癌和混合型肝癌的细胞来源及信号依赖差异较大。培养物需结合HNF4A、GPC3、KRT19等谱系信息，并以TERT启动子、CTNNB1、TP53、IDH1/2或FGFR2相关异常确认肿瘤身份。该类模型适合研究分子亚型、代谢依赖和靶向治疗反应。

4.5 前列腺癌类器官

        原发前列腺癌细胞的体外扩增能力有限，正常基底细胞常在培养中占据优势。模型确认应同时评价雄激素受体通路、原肿瘤特异基因异常及腔面上皮特征。对于去势抵抗性和神经内分泌型前列腺癌，应避免仅以AR或PSA阴性判断建系失败。

4.6 膀胱癌和肾癌类器官

        膀胱癌类器官可由切除组织、活检或尿液建立，适合比较不同分子亚型和FGFR通路相关药物反应。肾透明细胞癌培养物则应结合PAX8、CA9以及VHL通路异常确认来源。两类模型均需防止正常尿路或肾小管上皮细胞竞争性扩增。

4.7 卵巢癌和子宫内膜癌类器官

        高级别浆液性卵巢癌类器官可用于评价铂类、PARP抑制剂和同源重组修复状态，但不同肿瘤亚型不能仅依赖PAX8或WT1判定。子宫内膜癌类器官应结合错配修复、POLE、TP53及激素受体状态分层，才能将体外药物反应与临床分子亚型对应。

5 呼吸系统、乳腺及头颈部肿瘤类器官的培养特征

5.1 肺癌类器官

        肺癌样本中正常气道上皮细胞往往具有较强类器官形成能力，是造成假建系的重要原因。肺腺癌和肺鳞癌模型应分别结合组织谱系标志物及EGFR、KRAS、ALK、ROS1、MET或其他驱动改变确认。该模型主要用于靶向治疗敏感性、获得性耐药及原发灶与胸腔积液样本比较。

5.2 乳腺癌类器官

        乳腺癌类器官的培养结果容易受到雌激素、孕激素、胰岛素和IGF信号影响。ER阳性、HER2阳性和三阴性乳腺癌需要分别维持其受体状态和增殖特征，并与原组织的受体检测结果比较。研究内分泌耐药时，应采用明确的激素背景，而不能直接使用含复杂激素成分的培养体系。

5.3 头颈部鳞状细胞癌类器官

        头颈部鳞癌类器官可形成实性、分层或角化样结构，适合研究放疗、EGFR抑制及联合治疗。口咽癌样本还需结合HPV核酸和p16状态进行分层。由于原肿瘤常具有缺氧和免疫浸润特征，单纯上皮类器官对放疗和免疫治疗的模拟能力有限。

5.4 鼻咽癌类器官

        鼻咽癌与EB病毒感染密切相关，但病毒基因组和潜伏表达状态可能在培养过程中发生变化。模型建立后应连续监测病毒相关指标及原肿瘤驱动特征。其主要价值在于研究病毒相关肿瘤表型、放疗敏感性和免疫识别，而不是只评价类器官增殖速度。

5.5 唾液腺肿瘤类器官

        唾液腺肿瘤组织学类型多样，部分亚型由特定融合基因驱动。类器官鉴定应优先确认原肿瘤特异融合、腔面或肌上皮分化，而不是依赖通用上皮标志物。由于部分类型生长缓慢，长期培养中的亚克隆选择和正常腺体污染尤其需要关注。

6 神经系统、皮肤及其他肿瘤类器官的培养特征

6.1 胶质母细胞瘤类器官

        胶质母细胞瘤可采用解离细胞重聚或保留组织碎片的方式培养。组织片段模式更有利于维持局部缺氧、坏死样区域和细胞状态差异，但培养均一性较低。模型确认应结合原肿瘤的EGFR扩增、PTEN异常、TERT启动子状态及其他分子特征，而不能仅依据SOX2或GFAP表达。

6.2 脑转移瘤类器官

        脑转移瘤类器官应首先确认其谱系与原发癌一致，再比较转移灶与原发灶在药物敏感性和信号依赖方面的差异。培养过程中缺少脑内皮、星形胶质细胞和小胶质细胞，可能削弱脑微环境相关耐药表型，因此适合与脑来源基质细胞或微流控系统联合使用。

6.3 神经内分泌肿瘤类器官

        神经内分泌肿瘤在分化程度、增殖速度和激素分泌方面差异显著。类器官应结合CHGA、SYP、INSM1及原肿瘤特异分子异常确认，并通过激素或神经肽分泌评价功能。高分化和低增殖肿瘤可能难以长期扩增，建系失败不能直接解释为样本中没有肿瘤细胞。

6.4 黑色素瘤类器官

        黑色素瘤并非典型上皮性肿瘤，其三维培养更依赖细胞聚集、胶原环境和基质细胞支持。SOX10、MITF、MLANA及BRAF、NRAS或NF1状态可用于确认模型身份。该模型适合研究MAPK靶向耐药和免疫细胞杀伤，但纯肿瘤细胞培养不能充分反映免疫治疗反应。

6.5 肉瘤及间叶来源肿瘤模型

        肉瘤通常采用三维细胞球、组织碎片或可调硬度水凝胶培养，而不是标准上皮类器官体系。不同亚型应以融合基因、组织来源和间叶分化特征为主要鉴定依据。研究重点多为基质力学、细胞迁移、药物渗透和局部复发，而非腺体形成或上皮极性。

6.6 儿童与罕见肿瘤类器官

        儿童和罕见肿瘤样本有限，且常保留胚胎性或发育阶段特征。模型建立应优先保持驱动融合、扩增或特定分化程序，并尽量减少对正常发育祖细胞有利的培养选择。此类模型的主要价值是补充传统细胞系不足并支持罕见变异的药物验证。

7 肿瘤类器官的组织来源、谱系与功能标志物鉴定

7.1 原肿瘤与类器官的组织学一致性

        类器官应与原始肿瘤比较腺体结构、核异型性、黏液分泌、角化、细胞排列和坏死特征。组织形态一致能够支持模型代表性，但不能单独证明恶性来源，因为正常上皮细胞也可形成具有极性和腔体的三维结构。

7.2 组织谱系的确认

        组织特异性标志物用于判断类器官来源，例如CDX2和SATB2支持结直肠谱系，NKX2.1和Napsin A支持肺腺癌谱系，AR和NKX3.1支持前列腺谱系，PAX8可见于肾脏及部分女性生殖系统肿瘤。谱系标志物通常不是恶性特异指标，需要与病理和遗传证据联合使用。

7.3 驱动变异与拷贝数异常

        原肿瘤与类器官共有的驱动突变、融合基因、基因扩增或大片段缺失，是确认恶性身份的重要证据。检测时应关注变异等位基因频率和亚克隆比例，而不是只判断突变存在或不存在。正常细胞混入、肿瘤纯度变化和克隆选择均会改变检测结果。

7.4 正常与肿瘤类器官的区分

        正常上皮类器官通常保留较完整的组织分化程序和生长因子依赖性，但某些肿瘤类器官也可呈规则囊性结构。可靠区分应综合组织形态、肿瘤特异变异、拷贝数异常、非整倍体、因子非依赖性和药物反应，不能使用单一形态或增殖指标判定。

7.5 亚克隆组成与异质性评价

        通过多区域取材、单类器官测序、单细胞分析或不同培养条件平行建系，可观察亚克隆保留和选择情况。将全部类器官混合检测有利于评价总体特征，但可能掩盖低频克隆；单克隆扩增便于机制研究，却不能代表原肿瘤整体异质性。

7.6 功能表型鉴定

        肿瘤类器官的功能评价可包括生长因子非依赖性、侵袭、药物响应、DNA损伤、凋亡、代谢和克隆再生能力。功能读数应与研究目的直接对应，并通过类器官数量、面积、细胞数或总蛋白量归一化。单次ATP活率下降不足以区分细胞死亡、增殖停滞和代谢抑制。

表2 肿瘤类器官恶性身份确认的证据层级

8 肿瘤类器官在疾病建模、药物筛选与个体化治疗中的应用

8.1 驱动基因与肿瘤演化建模

        通过在正常组织类器官中逐步引入驱动变异，或在肿瘤类器官中修复特定异常，可分析不同突变在肿瘤发生和演化中的作用。等基因背景模型有利于区分单个变异效应，但仍需排除克隆选择、编辑脱靶和培养适应造成的差异。

8.2 临床时间窗口内的功能药敏

        活检来源类器官可在患者等待治疗期间开展候选药物比较，但建系、扩增和药筛周期必须与实际临床时间窗口匹配。快速药筛应优先选择与患者分子分型相关的有限药物组合，而不是追求覆盖大量缺乏临床可及性的化合物。

8.3 靶向治疗和化疗耐药研究

        治疗前后类器官可用于比较敏感克隆和耐药克隆的分子差异。耐药可能来自靶点突变、旁路通路激活、药物外排、DNA修复增强或表型转换。仅在长期药物暴露后获得耐药培养物，不能判断该机制是否在患者原肿瘤中已经存在。

8.4 联合用药与旁路通路识别

        肿瘤类器官适合采用剂量矩阵评价联合用药，并结合磷酸化信号、细胞周期和凋亡指标识别旁路通路。联合处理的抑制作用强于任一单药并不必然表示协同，应根据完整剂量范围和适当模型计算相互作用。

8.5 原发灶与转移灶反应差异

        同一患者的原发灶和转移灶可能具有不同亚克隆组成、器官适应性和治疗敏感性。分别建立类器官并进行平行检测，可识别只存在于转移灶的耐药特征，但取材时间和既往治疗差异必须纳入解释。

8.6 免疫细胞共培养

        肿瘤类器官可与肿瘤浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、巨噬细胞或工程化免疫细胞共培养，用于评价免疫识别和细胞毒性。实验需控制HLA匹配、效靶比、抗原表达和基质屏障，并区分肿瘤特异杀伤与非特异性细胞损伤。

8.7 肿瘤间质与血管环境重建

        引入癌相关成纤维细胞、内皮细胞或定义化基质，可研究旁分泌信号、药物渗透和肿瘤侵袭。共培养结果高度依赖不同细胞比例和培养基兼容性，因此应同时保留纯肿瘤类器官对照，明确观察到的变化来源于何种细胞组分。

8.8 类器官药敏与患者疗效的对应边界

        类器官可反映肿瘤细胞对药物的直接反应，但不能完整模拟药物吸收、分布、代谢、免疫作用和剂量限制性毒性。个体化治疗判断应将类器官药敏与病理、基因组、既往治疗和临床可用剂量联合分析，不能将体外敏感直接等同于患者一定获益。

9 肿瘤类器官建系、通路干预、药敏与微环境评价相关产品

9.1 肿瘤组织解离与三维建系产品

9.2 肿瘤克隆选择与通路干预产品

9.3 肿瘤类器官药敏与功能评价产品

9.4 肿瘤基质与旁分泌信号评价产品

        肿瘤类器官的价值不在于简单复制正常器官类器官的培养流程，而在于保留并识别患者肿瘤中的恶性克隆、通路依赖和治疗反应。通过控制培养选择压力、确认肿瘤身份，并比较治疗前后及不同病灶来源模型，可提高其在耐药机制研究和个体化药物评价中的可靠性。

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