坏死性凋亡（necroptosis）是一类以RIPK3–MLKL轴为核心执行机制的调节性细胞死亡，其质膜破裂可伴随DAMPs、肿瘤抗原及炎症信号释放，从而将细胞死亡与肿瘤免疫微环境变化直接连接。RIPK1依赖性信号、ZBP1介导的非经典RIPK3激活以及死亡前炎症转录共同决定其免疫输出，而不同细胞类型和微环境背景又可使坏死性凋亡呈现抗肿瘤或促肿瘤的双向效应。

        关键词：坏死性凋亡；RIPK1；RIPK3；MLKL；ZBP1；肿瘤免疫；免疫原性细胞死亡；免疫检查点阻断

1 坏死性凋亡的分子基础

1.1 与其他细胞死亡方式的区别

        坏死性凋亡属于调节性细胞死亡（regulated cell death，RCD），终末阶段可出现细胞肿胀、细胞器膨胀、质膜完整性丧失和胞内成分释放等坏死样特征，但其发生受RIPK3、MLKL等分子控制，因此不同于机械损伤或极端理化刺激造成的意外性坏死。经典凋亡主要依赖caspase级联，早期质膜通常保持完整；焦亡则主要依赖Gasdermin成孔。坏死性凋亡的核心特征不是单纯“细胞破裂”，而是RIPK3激活、MLKL磷酸化与膜损伤之间形成受调控的执行链。

表1 凋亡、坏死性凋亡、焦亡与非调控性坏死的主要差异

1.2 RIPK1–RIPK3–MLKL执行轴

（1）RIPK1依赖性启动

        TNF/TNFR1是经典坏死性凋亡信号之一。TNFR1激活后，RIPK1首先参与受体近端信号调控；当caspase-8活性受到抑制、RIPK1泛素化状态改变或促存活信号受限时，RIPK1激酶活性可促进死亡复合体形成，并通过RHIM介导的相互作用募集RIPK3，使细胞由存活或凋亡相关信号转向坏死性凋亡程序。

（2）RIPK3激活

        RIPK3是坏死性凋亡执行程序的关键激酶，但其活化并不绝对依赖RIPK1。除TNF相关的RIPK1–RIPK3途径外，ZBP1可通过RHIM直接连接RIPK3，TLR3/TLR4相关TRIF信号同样可进入RIPK3节点。RIPK3由此成为多种上游应激和先天免疫信号汇入坏死性凋亡执行程序的核心枢纽。

（3）MLKL磷酸化与膜破裂

        活化RIPK3磷酸化MLKL后，MLKL发生构象变化、寡聚化并向质膜重新分布，通过与膜脂相互作用扰乱离子稳态和膜结构，最终引起细胞肿胀、质膜通透性增加及裂解。人源MLKL常关注Ser358相关磷酸化，小鼠MLKL常关注Ser345，反映了不同物种在执行位点上的差异。

1.3 ZBP1与非经典RIPK3激活

（1）Z构象核酸识别

        ZBP1含有Zα结构域，可识别Z构象核酸。在病毒感染、内源性核酸稳态异常及特定肿瘤应激条件下，ZBP1能够感知异常核酸并激活RIPK3，其中Z-RNA是多种生理和抗病毒场景中的重要信号来源。染色质或核酸稳态发生变化时，Z构象核酸增加也可使ZBP1成为连接核酸异常与细胞死亡的重要感知节点。

（2）ZBP1–RIPK3直接连接

        ZBP1通过RHIM结构域与RIPK3建立直接信号联系，使RIPK3能够绕过RIPK1接受上游死亡信号，并进一步激活MLKL。ZBP1–RIPK3–MLKL轴构成RIPK1非依赖性坏死性凋亡的重要形式，也使核酸感知、先天免疫和裂解性细胞死亡在同一信号网络中发生交叉。

2 坏死性凋亡如何转化为肿瘤免疫信号

2.1 裂解性死亡的免疫输出

（1）DAMPs释放

        MLKL介导的质膜破裂可使HMGB1、ATP及其他胞内危险信号进入细胞外环境。DAMPs可被局部先天免疫细胞感知，改变树突状细胞、巨噬细胞及其他髓系细胞的活化状态，使坏死性凋亡不仅表现为细胞数量减少，也成为肿瘤微环境中的炎症信号来源。

（2）肿瘤抗原暴露

        肿瘤细胞裂解同时释放或暴露肿瘤相关抗原，为抗原递呈细胞提供新的抗原来源。DAMPs主要承担危险信号功能，肿瘤抗原则提供适应性免疫识别的靶标，二者能否形成有效耦联决定了坏死性凋亡是否进一步转化为免疫原性细胞死亡。

2.2 树突状细胞与抗原交叉递呈

（1）树突状细胞成熟

        发生坏死性凋亡的肿瘤细胞可同时向树突状细胞提供抗原及炎症刺激，促进其成熟并提高共刺激分子表达。DC状态的改变是连接死亡肿瘤细胞与T细胞免疫的重要中间环节。

（2）MHC-I交叉递呈

        树突状细胞摄取死亡肿瘤细胞来源的外源性抗原后，可将部分抗原导入MHC-I交叉递呈途径，使肿瘤来源抗原被CD8+ T细胞识别。坏死性凋亡由此从局部细胞死亡扩展为可启动肿瘤特异性适应性免疫的信号事件。

2.3 CD8+ T细胞与效应免疫建立

（1）CD8+ T细胞启动

        经过抗原递呈和共刺激，肿瘤特异性CD8+ T细胞可进一步扩增并向肿瘤组织募集。其作用不再局限于最初发生坏死性凋亡的细胞，而可向未直接受到死亡刺激的肿瘤区域扩展。

（2）效应功能增强

        进入肿瘤组织的效应性CD8+ T细胞可产生IFN-γ、Granzyme B等分子，并增强对抗原阳性肿瘤细胞的细胞毒性作用。部分环境中，NK细胞及其他先天效应细胞也可响应坏死性凋亡形成的趋化和炎症信号，共同改变局部免疫杀伤能力。

2.4 死亡前炎症转录输出

        坏死性凋亡的免疫效应并不完全依赖细胞裂解。RIPK1、RIPK3以及与其耦联的NF-κB等信号可在质膜完全破裂之前改变细胞因子和趋化因子表达，使即将死亡的细胞主动参与炎症环境塑造。MLKL介导的裂解性输出主要提供DAMPs和抗原，而死亡前转录更多影响免疫细胞募集及局部炎症信号，两者共同决定坏死性凋亡的免疫原性强度。

3 坏死性凋亡对肿瘤微环境的双向作用

3.1 抗肿瘤方向

（1）肿瘤细胞死亡与抗原供给

        肿瘤细胞发生坏死性凋亡时，可同时提供肿瘤抗原、DAMPs和炎症趋化信号。在具备有效DC和效应T细胞的环境中，这一过程可增强抗原交叉递呈及肿瘤特异性免疫，并为凋亡执行缺陷或部分治疗抵抗型肿瘤提供另一种细胞死亡途径。

（2）效应免疫扩大

        初始死亡事件形成有效抗原递呈后，可进一步扩大CD8+ T细胞及其他效应免疫细胞参与范围，使死亡效应从局部肿瘤细胞延伸至更广泛的肿瘤区域。此时坏死性凋亡的作用不仅体现为直接减少肿瘤细胞，也体现为推动免疫系统参与后续清除。

3.2 促肿瘤或免疫抑制方向

（1）微环境细胞损伤

        坏死性凋亡可发生于CAF、内皮细胞和免疫细胞。CAF死亡可能削弱部分肿瘤支持性基质和旁分泌网络，但内皮细胞或效应免疫细胞持续坏死性凋亡也可能损伤血管功能、免疫细胞进入及局部杀伤能力，因此死亡细胞类型是决定最终方向的重要因素。

（2）持续炎症与髓系重塑

        长期、广泛的裂解性死亡可维持DAMPs和炎症介质释放，促进组织修复相关反应和髓系细胞持续募集。当免疫抑制性髓系环境逐渐占优势时，炎症本身不再等同于有效抗肿瘤免疫，而可能成为肿瘤适应和免疫逃逸的一部分。

3.3 时间与空间依赖性

        坏死性凋亡的肿瘤效应还受到持续时间和空间位置影响。短时、局灶性的肿瘤细胞坏死性凋亡可形成集中而有效的抗原和危险信号释放，而长期存在于缺氧坏死区的裂解性死亡则更容易形成慢性组织损伤。坏死性凋亡在肿瘤中的意义，本质上取决于死亡发生的细胞类型、空间位置、持续状态及其所处的免疫背景。

4 RIPK3相关转录重编程与ZBP1信号

4.1 RIPK3–TRIM28与免疫转录输出

（1）TRIM28调控

        TRIM28具有转录共抑制和染色质调控功能。在部分肿瘤模型中，RIPK3激活可影响TRIM28的磷酸化状态及其转录抑制作用，使部分原本受到限制的免疫相关基因表达增强。

（2）细胞因子与趋化因子输出

        TRIM28调控变化可进一步影响NF-κB、SOX9等相关转录网络以及细胞因子、趋化因子表达，使RIPK3在MLKL介导的膜破裂之外参与免疫微环境塑造。RIPK3由此同时具有死亡执行上游激酶和免疫转录调节节点两类功能。

4.2 ADAR1–ZBP1信号调控

（1）ADAR1维持核酸免疫稳态

        ADAR1参与双链RNA编辑和内源性核酸免疫稳态调控，其p150亚型含有Zα结构域，可限制异常核酸相关免疫信号。完整的ADAR1功能有助于降低内源性核酸持续触发先天免疫感知的概率。

（2）ZBP1信号释放

        ADAR1相关保护机制下降时，异常核酸感知增强，ZBP1更容易进入RIPK3信号节点，并在具备完整MLKL执行能力的细胞中形成ZBP1–RIPK3–MLKL依赖性坏死性凋亡。ADAR1由此连接RNA稳态、Z构象核酸感知和坏死性凋亡敏感性。

4.3 CBL0137与ZBP1依赖性间质重塑

        CBL0137属于FACT相关调控化合物，在特定体系中可增加Z构象核酸相关应激并激活ZBP1–RIPK3–MLKL信号。部分肿瘤模型中，这一作用可发生于肿瘤相关成纤维细胞等间质细胞，通过削弱支持性基质和旁分泌网络改变局部免疫环境。该模式说明坏死性凋亡的抗肿瘤作用并不一定来自直接杀伤肿瘤细胞，也可能由肿瘤间质重塑产生。

5 坏死性凋亡与免疫检查点阻断

5.1 ICB敏感性的免疫基础

（1）抗原递呈改善

        坏死性凋亡可增加肿瘤抗原暴露和危险信号，为DC成熟及交叉递呈提供条件。原本抗原释放不足或抗原递呈效率较低的肿瘤，在这一过程中可能形成更有利于T细胞启动的局部免疫环境。

（2）效应T细胞进入

        趋化因子和炎症信号改变可进一步促进CD8+ T细胞进入肿瘤组织，使原本效应淋巴细胞不足的肿瘤向更具有免疫反应性的状态转变。ICB在这一背景下主要解除已经存在或被重新启动的T细胞抑制状态。

5.2 与ICB联合的双向结果

        坏死性凋亡与ICB的潜在协同，本质上是免疫启动增强与效应抑制解除的结合。RIPK3–MLKL执行、ZBP1相关核酸感知、肿瘤抗原性以及间质环境均可影响这种协同强度；若坏死性凋亡主要造成持续组织裂解，而未改善抗原递呈和效应T细胞状态，则难以转化为有效的ICB增敏。

6 坏死性凋亡的实验判定

6.1 核心证据链

（1）膜完整性与动态形态

        坏死性凋亡执行过程中可出现细胞肿胀、质膜通透性增加和最终膜破裂，PI、7-AAD摄取及LDH释放可用于评价裂解性死亡进程，延时活细胞成像能够进一步解析死亡发生顺序。这些指标缺乏坏死性凋亡特异性，应与RIPK3–MLKL通路状态结合判定。

（2）RIPK3–MLKL激活

        p-RIPK3和p-MLKL比总RIPK3、总MLKL更能反映通路功能状态，其中p-MLKL结合MLKL膜转位或寡聚化可进一步支持其进入执行阶段。仅检测RIPK1、RIPK3或MLKL总蛋白表达升高，不能确认坏死性凋亡已经发生。

（3）药理学救援

        RIPK1依赖模型可采用Necrostatin-1、Nec-1s等抑制剂验证，RIPK3抑制剂可用于确认RIPK3依赖性，部分人源模型可使用Necrosulfonamide干预MLKL。不同抑制剂具有物种选择性、靶点差异和潜在脱靶效应，采用不同节点的药理学干预可提高通路归因可靠性。

（4）遗传学验证

        RIPK3或MLKL敲低/敲除后，如果p-MLKL、膜破裂和总体死亡同步下降，可显著增强坏死性凋亡归因。RIPK1缺失主要用于判断模型是否依赖RIPK1；对于ZBP1或TRIF进入RIPK3的通路，RIPK1抑制无效并不能排除坏死性凋亡。

6.2 与其他死亡方式的鉴别

（1）与凋亡区分

        cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、cleaved PARP等明显增强，并可被caspase抑制剂降低时，更支持caspase依赖性凋亡。部分TNF相关模型中，caspase-8受抑可促进RIPK1/RIPK3/MLKL依赖性坏死性凋亡，因此Z-VAD类抑制剂既可用于分析凋亡依赖性，也可能成为坏死性凋亡诱导条件的一部分。

（2）与焦亡区分

        焦亡通常伴随炎症caspase激活、GSDMD裂解以及IL-1β/IL-18成熟。由于焦亡和坏死性凋亡均可出现细胞肿胀、PI阳性和LDH释放，需要分别检测GSDMD执行轴和RIPK3–MLKL执行轴；若两者同时激活，则可能存在多种调节性细胞死亡并行。

（3）与铁死亡区分

        铁死亡应结合脂质ROS、GPX4、GSH、ACSL4等指标以及Ferrostatin-1、Liproxstatin-1等救援实验判断。铁死亡并不以RIPK3–MLKL激活和典型MLKL介导膜破裂为核心执行机制。

（4）与非调控性坏死区分

        非调控性坏死通常缺乏稳定的特异性执行信号轴，而更多由严重物理、化学或代谢损伤直接导致。RIPK3–MLKL特异性激活、裂解性死亡表型及药理或遗传救援共同构成坏死性凋亡与一般性坏死区分的主要依据。

表2 坏死性凋亡常见实验结果的联合判读

6.3 实体瘤中的空间异质性与细胞来源

（1）区域异质性

        实体瘤中的坏死性凋亡通常并非均匀分布，坏死区、缺氧区、侵袭边缘、血管周围及免疫浸润区域可能具有不同的p-MLKL状态。整块肿瘤Western blot容易因阳性区域比例较低而稀释局部信号，可结合H&E、p-MLKL免疫组织化学或免疫荧光进行空间定位。

（2）细胞来源

        肿瘤组织中的p-MLKL信号可能来自肿瘤细胞、CAF、内皮细胞或免疫细胞，而不同细胞群中的坏死性凋亡具有不同免疫后果。可结合细胞类型标志进行共定位，必要时采用细胞分选、区域取样或显微切割进一步确定信号来源。

（3）时间顺序

        RIPK3激活、MLKL磷酸化、膜破裂和继发免疫变化存在时间先后。早期信号读出、中期膜损伤以及后期DC和T细胞变化不宜由单一时间点替代，尤其在分析坏死性凋亡与肿瘤免疫之间的因果关系时，应区分死亡启动、执行和继发免疫重塑。

7 坏死性凋亡通路干预、死亡方式鉴别及检测相关产品

7.1 RIPK1、RIPK3、MLKL及caspase干预相关产品

7.2 死亡方式鉴别及排除对照相关产品

7.3 膜破裂、细胞活性及关键通路蛋白检测产品

        坏死性凋亡通过RIPK1或ZBP1介导的RIPK3–MLKL激活，将裂解性死亡、DAMPs与肿瘤抗原释放、炎症转录及免疫细胞重塑连接起来。其肿瘤效应取决于死亡细胞类型、空间位置、持续状态及局部免疫背景，既可启动抗原递呈和效应免疫，也可能转化为持续性炎症和免疫抑制性微环境。

参考文献

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